Аргинин акг: AAKG (Arginine AKG) Capsules 120 (Be First) PitProfi

Вся литература, подобранная вручную по указанному гену, организована по темам в соответствии с их отношение к гену (основная литература, дополнительная литература или обзор).Нажмите «Сведения о литературе». для просмотра всей литературной информации по этому локусу, включая общую литературу по генам.

Первичный

5

Дополнительный

16

Обзоры

5

ресурсов

Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Аргинин — это аминокислота, которая синтезируется в организме. Пероральный аргинин применялся при различных состояниях, таких как гипертония, стенокардия, атеросклероз, мигрень и эректильная дисфункция. Считается, что его сосудорасширяющие свойства ответственны за положительный эффект. Аргинин также используется для улучшения заживления ран, улучшения иммунной функции и улучшения спортивных результатов.

Некоторые исследования подтверждают использование аргинина при заболеваниях коронарных и периферических артерий ^{(10) (11) (12) (13)} , но длительный прием добавок ухудшил PAD ⁽¹⁴⁾ .Кроме того, пероральный прием добавок у пациентов с острым инфарктом миокарда не улучшил фракцию выброса или жесткость сосудов и может быть связан с более высокой смертностью ⁽³⁸⁾ . Мета-анализ добавки аргинина на маркеры сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения или диабета также не обнаружил положительных результатов, за исключением, возможно, избранной группы пациентов ⁽³⁹⁾ . Более мелкие исследования показывают, что добавление аргинина, глутамина и HMB может улучшить функцию эндотелия сосудов у пожилых людей ⁽³³⁾ , но добавление аргинина само по себе не улучшило кровоток или работоспособность мышц у пожилых женщин ⁽³⁴⁾ .

Наряду с витаминами-антиоксидантами аргинин снижает частоту преэклампсии у женщин с высоким риском ⁽²⁸⁾ , но добавки аргинина не улучшают артериальное давление или функцию почек у женщин с преэклампсией ⁽¹⁵⁾ . Предварительные данные предполагают потенциальную пользу приема аргинина при эректильной дисфункции ^{(16) (40)} . Аргинин в сочетании с ибупрофеном может усиливать обезболивание у пациентов с мигренью ⁽¹⁷⁾ . Энтеральный аргинин снижает шок у пациентов с тяжелыми ожогами ⁽⁴⁾ и может быть полезен в качестве дополнительной терапии у пациентов с активным туберкулезом ⁽²⁹⁾ .

У онкологических больных предварительные результаты смешаны для периоперационных энтеральных смесей, обогащенных аргинином для улучшения заживления ран ^{(1) (41)} и иммунной функции ^{(27) (35) (42)} , но другие исследования показывают, что такие формулы могут уменьшить осложнения и продолжительность пребывания в больнице ^{(30) (36)} . Некоторые данные предполагают, что профилактическая добавка, содержащая аргинин, может снизить частоту синдрома кистей и стоп у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, принимающих сорафениб ⁽⁴³⁾ .Интересно, что лечение на основе аргининовой депривации также рассматривается как потенциальное лечение рака. ^{(31) (32) (37)} .

Хотя метаанализ не обнаружил значительного влияния добавок аргинина на воспалительные биомаркеры, анализ подгрупп предполагает, что он может увеличивать циркулирующий С-реактивный белок у онкологических больных, у пациентов старше 60 лет или с более высокими исходными уровнями СРБ, или при использовании энтерального введения. формулы ⁽⁴⁴⁾ .Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить обстоятельства, при которых добавление аргинина может быть безопасным и эффективным.

Полимерный наноноситель с пептидом, активирующим кислотность опухоли, обогащенным аргинином (R9), для улучшенной доставки лекарств

* Соответствующие авторы

Первая народная больница Гуанчжоу, медицинский факультет Южно-Китайского технологического университета, Гуанчжоу 510006, P. R. Китай
Эл. Почта: [email protected], [email protected]

^б Институты наук о жизни, Школа медицины, Южно-Китайский технологический университет, Гуанчжоу, Гуандун 510006, P.R. Китай

^с Школа биомедицинских наук и инженерии, Международный кампус Гуанчжоу, Южно-Китайский технологический университет, Гуанчжоу 510006, П. Р. Китай

^д Народная больница провинции Гуандун, Академия медицинских наук Гуандун, Университет китайской медицины Гуанчжоу, Гуанчжоу, Гуандун 510006, P. R. Китай

^e Ключевая лаборатория биомедицинских материалов и инженерии Министерства образования, Южно-Китайский технологический университет, Гуанчжоу 510006, П. Р. Китай

^f Ключевая лаборатория биомедицинской инженерии провинции Гуандун и Инновационный центр восстановления и реконструкции тканей Южно-Китайского технологического университета, Гуанчжоу 510006, P.R. Китай

^г Гуанчжоуская лаборатория регенеративной медицины и здоровья Гуандун, Гуанчжоу 510005, Китайская Республика

Аминокислоты и их символы

DALRD3 кодирует белок, мутировавший при эпилептической энцефалопатии, который нацелен на тРНК аргинина для модификации 3-метилцитозина

METTL2 взаимодействует с предполагаемым тРНК-связывающим белком DALRD3

Чтобы идентифицировать белки, которые взаимодействуют с METTL2Aonic человека или 2T человека, мы создали линии клеток, стабильно экспрессирующие METTL2A или METTL2B, слитые с меткой очистки Twin-Strep ³⁵ . Для сравнения мы также создали клеточную линию 293T, стабильно экспрессирующую Strep-tagged METTL6, другой гомолог Trm140 человека. Strep-METTL2A, METTL2B и METTL6 подвергали аффинной очистке из экстрактов цельных клеток на стрептактиновой смоле, элюировали биотином и анализировали путем окрашивания серебром для обнаружения взаимодействующих белков. Мы идентифицировали близко мигрирующий дублет полос ~ 50 кДа вместе с полосой ~ 30 кДа, которые были обогащены METTL2A и METTL2B по сравнению с контрольной очисткой (рис. 1a, стрелки).Иммуноблоттинг с использованием антител против метки Strep показал, что одна из полос 50 кДа была очищенной Strep-METTL2A / B (дополнительный рисунок 1). Очистка METTL6 давала полосы ~ 60, 40 и 30 кДа (рис. 1а, стрелки). Полоса 40 кДа соответствует очищенному Strep-METTL6, обнаруженному иммуноблоттингом с антителами против метки Strep (дополнительный рисунок 1).

Фиг. 1: METTL2A / B человека взаимодействует с антикодон-связывающим доменом DALR, содержащим 3 (DALRD3).

a Анализ окрашивания серебром очищенных Strep-METTL2A, 2B и 6 из человеческих клеток 293T.Стрелки обозначают полосы, которые обогащены METTL2A, 2B и 6 очистками по сравнению с контролем. Звездочки обозначают неспецифические загрязнители, обнаруженные во всех трех очистках. b Белковые совпадения, обнаруженные с помощью ЖХ-МС анализа пептидов, присутствующих в указанных очистках белков. c Иммуноблот-анализ контроля, очистки METTL2A, METTL2B и METTL6. Иммуноблоттинг зондировали антителами против TwinStrep и против DALRD3. Вход составляет 1% от общей суммы. Звездочка представляет собой неспецифическую полосу.Процент очищенного DALRD3 представляет собой долю DALRD3, извлеченную из общего количества введенных при каждой очистке. N = 1. d Покрытие обратной очистки DALRD3 в образцах белка, проанализированных с помощью ЖХ-МС. e Схема цитозольной аргинил-тРНК-синтетазы (RARS), митохондриальной аргинил-тРНК-синтетазы (RARS2) и DALRD3. Указаны домены, представляющие митохондриальный нацеливающий сигнал (MTS), каталитическое ядро ​​аминоацилсинтетазы и антикодон-связывающий домен DALR.Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Для идентификации взаимодействующих с METTL белков все элюаты после каждой очистки обрабатывали для идентификации пептидов с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Как и ожидалось, пептидные последовательности, соответствующие METTL2A, METTL2B и METTL6, были обнаружены в соответствующих очистках Strep-METTL2A, 2B и 6 (фиг. 1b). Кроме того, обе очистки METTL2A и 2B содержали пептиды, соответствующие не охарактеризованному белку, кодируемому геном DALR антикодон-связывающего белка 3 ( DALRD3 ) (рис.1b, дополнительные данные 1). Молекулярные массы двух предсказанных изоформ DALRD3 составляют 55 и 59 кДа, что соответствует по размеру неидентифицированным полосам в дублете, наблюдаемым при окрашивании серебром. Для очистки METTL6 мы обнаружили многочисленные пептиды серил-тРНК синтетазы (SARS) (рис. 1b, дополнительные данные 1). Молекулярная масса SARS (59 кДа) близко по размеру к полосе 60 кДа, обнаруженной окрашиванием серебром при очистке METTL6. Более того, SARS был недавно идентифицирован как взаимодействующий с METTL6 ³² .Однако пептиды, соответствующие DARLD3, не были идентифицированы при очистке METTL6. Эти результаты предполагают, что DALRD3 формирует уникальное взаимодействие с METTL2A и 2B.

Чтобы подтвердить взаимодействие DALRD3 и его специфичность, мы временно экспрессировали и очищали METTL2A, METTL2B и METTL6 с последующим зондированием антителами против DALRD3. Иммуноблот-анализ выявил совместную очистку эндогенного DALRD3 со Strep-METTL2A или METTL2B, которая не была очевидна со Strep-METTL6 (рис.1в). В качестве дополнительного доказательства того, что METTL2A и B взаимодействуют с DALRD3, мы также выполнили реципрокную очистку DALRD3 из клеток 293T человека, стабильно экспрессирующих Strep-tagged DALRD3. Используя анализ ЖХ-МС, мы обнаружили несколько уникальных совпадений пептидов с METTL2A и 2B при очистке DALRD3, что указывает на связь между DALRD3 и эндогенным METTL2A / B (рис. 1d, дополнительные данные 2). Эти результаты идентифицируют DALRD3 как взаимодействующего партнера METTL2A и 2B.

DALRD3 представляет собой не охарактеризованный белок, содержащий карбокси-концевую последовательность, гомологичную «DALR» антикодон-связывающему домену, обнаруженному в аргинил-тРНК-синтетазах от архей до эукариот ³⁶ .Домен DALR назван в честь характерных консервативных аминокислот, присутствующих в последовательности первичного белка, и складывается в полностью альфа-спиральную структуру, как это наблюдается в S. cerevisiae аргинил-тРНК-синтетазе ^36,37,38 . В отличие от карбоксиконца, аминоконцевая часть DALRD3 не содержит узнаваемых мотивов или доменов и специфична только для гомологов DALRD3. В то время как гомологи DALRD3 еще не идентифицированы у одноклеточных эукариот или беспозвоночных, гомологи DALRD3 могут быть обнаружены у всех секвенированных позвоночных, от примитивных бесчелюстных рыб до млекопитающих ^39,40 . У позвоночных канонический домен DALR обнаруживается в цитоплазматической аргинил-тРНК синтетазе 1 (RARS1) и митохондриальной аргинил-тРНК синтетазе 2 (RARS2) в дополнение к DALRD3 (Fig. 1e). В отличие от RARS1 и RARS2, однако, DALRD3 лишен узнаваемого каталитического мотива тРНК синтетазы, тем самым подтверждая особую функцию DALRD3 вне аминоацилирования тРНК.

Комплекс METTL2-DALRD3 связывает различные тРНК аргинина

Основываясь на структуре S. cerevisiae аргинил-тРНК синтетазы, домен DALR образует карман связывания нуклеиновой кислоты, который распознает сторону малой бороздки стеблей антикодона аргининовой тРНК через дер Ваальса, гидрофобные и электростатические взаимодействия ³⁷ .Таким образом, мы исследовали, взаимодействует ли DALRD3 с тРНК, и если да, существует ли конкретная специфичность связывания для DALRD3. Чтобы выяснить взаимодействия РНК, опосредованные DALRD3, мы временно экспрессировали и очищали Strep-DALRD3 из клеток 293T либо отдельно, либо с помощью FLAG-METTL2A / B (рис. 2a). После связывания со стрептактиновой смолой мы подтвердили очистку Strep-DALRD3 вместе с совместной очисткой METTL2A или 2B (рис. 2а). Эти результаты дополнительно подтверждают взаимодействие между DALRD3 и METTL2A / B, как показано выше.

a Иммуноблотинг Strep-DALRD3, очищенного из клеток 293T, экспрессированных отдельно или в сочетании с FLAG-METTL2A / B. Иммуноблоттинг зондировали антителами против TwinStrep и против FLAG. Нагрузка представляет собой полосу неспецифического белка, обнаруженную антителом против Strep, используемым в качестве контроля нагрузки. b Окрашивание нуклеиновой кислотой РНК, экстрагированных из указанных исходных или очищенных образцов после денатурирующего PAGE.Обозначены паттерны миграции 5.8S рРНК (~ 150 нуклеотидов), 5S рРНК (~ 120 нуклеотидов) и тРНК (~ 70-80 нуклеотидов). c Нозерн-блот анализ геля в b с использованием указанных зондов. Вход составляет 2% от общего количества экстрактов, используемых для очистки. Процентный выход представляет собой количество РНК при очистке Strep, которая была выделена из общего ввода. Эксперимент проводился трижды с сопоставимыми результатами. Количественный анализ был выполнен на показанном блоте. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Затем мы исследовали виды РНК, которые очищали совместно с DALRD3, денатурируя PAGE с последующим окрашиванием нуклеиновой кислотой. Хотя при контрольной очистке РНК не было обогащено, очистка Strep-DALRD3 содержала несколько видов совместно очищающих РНК, которые соответствуют по размеру 5S и 5,8S рРНК вместе с тРНК (фиг. 2b, дорожка 10). Следует отметить, что мы наблюдали значительное снижение совместной очистки 5S и 5.8S рРНК с DALRD3 при совместной экспрессии с METTL2A или 2B (фиг. 2b, сравните дорожку 10 с дорожками 11 и 12).Однако совместная очистка тРНК с DALRD3 сохранялась при совместной экспрессии с METTL2A или 2B. Эти результаты показывают, что DALRD3 взаимодействует с рРНК и тРНК, когда сверхэкспрессируется и очищается отдельно, но смещается в сторону преимущественно связывающих тРНК при сборке в комплекс с METTL2A / B.

Чтобы определить специфичность связывания тРНК DALRD3, мы исследовали очистку DALRD3 для различных тРНК с помощью Нозерн-блоттинга. Примечательно, что мы обнаружили, что очистка DALRD3 была значительно обогащена аргининовыми тРНК, которые, как известно, содержат m3C, генерируемый METTL2A / B (рис.2c, дорожки 10–12, тРНК-Arg-CCU и UCU). Напротив, изоакцепторы тРНК аргинина, лишенные m3C, обнаруживают значительно меньшую совместную очистку с DALRD3 (рис. 2c, дорожки 10–12, тРНК-Arg-UCG, CCG и ACG). В соответствии с предсказанной специфичностью домена DALR для аргининовых тРНК, только фоновые уровни тРНК-Thr-AGU или Ser-UGA присутствовали в любой из очисток DALRD3, независимо от того, экспрессируется ли она совместно с METTL2A / B или без него (рис. 2c, Thr -АГУ и Сер-УГА, переулки 10–12). В совокупности эти результаты раскрывают отчетливую специфичность связывания тРНК для DALRD3, которая контрастирует с аргинил-тРНК синтетазами, которые распознают все изоакцепторы тРНК аргинина независимо от антикодона.

DALRD3 способствует связыванию METTL2A / B с тРНК-Arg-CCU и UCU

Совместная очистка DALRD3 с METTL2A и 2B наряду с особой специфичностью связывания тРНК DALRD3 предполагает, что DALRD3 играет роль в нацеливании на METTL2A / B. специфические тРНК аргинина для модификации m3C. Чтобы проверить эту гипотезу, мы временно экспрессировали Strep-METTL2A или 2B с коэкспрессией FLAG-tagged DALRD3 или без нее в клетках 293T. Иммуноблот-анализ исходных экстрактов подтвердил экспрессию Strep-METTL2A / B либо отдельно, либо с FLAG-DALRD3 (рис.3а, дорожки 2, 3, 5 и 6). Благодаря процедуре трансфекции, METTL2A и 2B проявляли пониженные уровни экспрессии при совместной экспрессии с DALRD3 по сравнению с METTL2A или 2B, экспрессируемыми отдельно. Используя этот подход, мы обнаружили совместную очистку FLAG-DALRD3 со Strep-METTL2A или 2B, что еще раз подтвердило наш вывод о том, что METTL2A / B взаимодействует с DALRD3 (рис. 3a, дорожки 11 и 12). Мы также обнаружили, что взаимодействие между DALRD3 и METTL2A / B сохраняется после обработки РНКазой, что позволяет предположить, что взаимодействие METTL2 с DALRD3 не передается через РНК (дополнительный рис.2).

a Иммуноблот-анализ очистки Strep-METTL2A / B, экспрессированного отдельно или с FLAG-DALRD3, из эмбриональных клеток человека 293T. Иммуноблоттинг зондировали антителами против TwinStrep и против FLAG. Нагрузка представляет собой полосу неспецифического белка, обнаруженную антителом против Strep, используемым в качестве контроля нагрузки. Вход составляет 2% от общей суммы. b Окрашивание нуклеиновой кислотой РНК, экстрагированных из указанных исходных или очищенных образцов после денатурирующего PAGE.Обозначены паттерны миграции тРНК (70–80 н.), 5.8S рРНК (~ 150 н.) И 5 S рРНК (~ 120 н.). c Нозерн-блоттинг METTL2A / B-ассоциированных РНК с указанными зондами. Справа обозначено известное присутствие или отсутствие m3C и фермента METTL, который генерирует m3C в данной тРНК. Очистку повторяли трижды с аналогичными результатами. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Анализ соочищающих РНК выявил совместную очистку тРНК как с METTL2A, так и с 2B (рис.3б, дорожки 8–9 и 11–12). Более того, наблюдалось увеличение количества тРНК, совместно очищаемых с METTL2A или 2B, когда каждая из них коэкспрессировалась с DALRD3 (фиг. 3b, сравните дорожки 8 и 9 с 11 и 12). Увеличение количества тРНК, очищаемых совместно с METTL2A / B при совместной экспрессии с DALRD3, не связано с увеличением экспрессии или очистки METTL2A / B, поскольку фактически в присутствии DALRD3 экспрессировалось и очищалось меньше METTL2A / B (рис. 3a). , дорожки 11 и 12).

Используя Нозерн-блот-гибридизацию, мы обнаружили низкие уровни коочистки тРНК-Arg-CCU и UCU только с METTL2A или B, но не с тРНК-Arg-CCG, ACG или UCG (рис.3c, дорожки 8 и 9). Кроме того, мы обнаружили, что тРНК-Thr-AGU также совместно очищается с METTL2A или 2B, когда экспрессируется отдельно (фиг. 3c, дорожки 8 и 9, Thr-AGU). Для сравнения мы обнаружили только фоновые уровни тРНК-Ser-UGA, тРНК-Gln-UUG или U6 мяРНК в любой из очисток (рис. 3c, дорожки 7–12). Взаимодействие METTL2A и 2B с тРНК-Thr-AGU, Arg-CCU и Arg-UCU, но не с другими изоакцепторами тРНК-Arg или тРНК-Ser-UGA, согласуется с субстратной специфичностью METTL2A / B ³² .Примечательно, что количество тРНК-Arg-CCU или UCU значительно увеличивалось при очистке METTL2A или 2B при совместной экспрессии с DALRD3 (рис. 3c, тРНК-Arg-CCU или UCU, сравните дорожки 8 и 9 с дорожками 11 и 12). ). Напротив, взаимодействие между METTL2A или 2B с тРНК-Thr-AGU было нарушено коэкспрессией с DALRD3 (фиг. 3c, сравните дорожки 8 и 9 с дорожками 11 и 12).

Усиление взаимодействия METTL2A / B с аргининовыми тРНК за счет коэкспрессии DALRD3 свидетельствует о том, что сборка комплекса METTL2-DALRD3 облегчает распознавание и нацеливание на специфические субстраты аргининовой тРНК для модификации m3C.Незначительная совместная очистка тРНК-Arg-CCU или UCU с METTL2A / B при экспрессии отдельно может быть связана с небольшой популяцией METTL2A / B, образующей комплекс с эндогенным DALRD3, что согласуется с нашей первоначальной идентификацией DALRD3 с METTL2A / B через масс-спектрометрии. Более того, обогащение тРНК-Arg-CCU и -UCU в сочетании с сопутствующим снижением связывания тРНК-Thr-AGU с помощью METTL2A / B предполагает, что взаимодействие с DALRD3 ограничивает специфичность связывания тРНК METTL2A / B в отношении определенных изоакцепторов тРНК-Arg. .

тРНК, стабильно связанные с METTL2 и / или DALRD3, могут представлять субстраты, которые еще не были модифицированы с помощью m3C и / или были модифицированы, но не диссоциированы. Чтобы установить относительное состояние модификации m3C совместно очищающих тРНК, мы использовали олигонуклеотидный зонд, который отображает дифференциальную гибридизацию на основе статуса модификации m3C (более подробно описано ниже). Используя этот зонд, мы обнаружили, что DALRD3 очищается совместно как с модифицированной, так и с немодифицированной тРНК-Arg-UCU и Arg-CCU (дополнительный рис.3а). Напротив, мы обнаружили, что большинство тРНК-Arg-UCU и Arg-CCU, которые совместно очищались с помощью METTL2, были модифицированы с помощью m3C (дополнительный рис. 3b). Эти результаты согласуются с тем, что белок DALRD3 связывает немодифицированную тРНК-Arg-UCU или CCU для последующего метилирования при взаимодействии с METTL2.

Требования к последовательности тРНК для метилирования с помощью METTL2-DALRD3

Геномы млекопитающих экспрессируют пять различных изоакцепторов тРНК, которые декодируют кодоны аргинина, но только тРНК-Arg-CCU и Arg-UCU модифицированы, чтобы содержать m3C в положении 32 (рис.4а) ^17,20,41 . Интересно, что тРНК-Arg-UCG и Arg-ACG также содержат C32, но не модифицируются METTL2A / B ни в человеческих, ни в мышиных клетках. Проверка петель ствола изоакцептора показывает, что тРНК-Arg-CCU и Arg-UCU содержат U-A в положениях 36 и 37, тогда как тРНК-Arg-CCG, UCG и ACG содержат G-G в положениях 36 и 37 (рис. 4a). Мы также отмечаем, что тРНК-Thr-AGU, которая является субстратом для METTL2A / B, также содержит динуклеотид U-A в положениях 36 и 37 (рис. 4a, Thr-AGU). Более того, A37 модифицируется до N6-треонилкарбамоладенозина (t6A) в тРНК-Arg-CCU и Arg-UCU вместе с тРНК-Thr-AGU.Предыдущие исследования S. cerevisiae и S. pombe показали, что идентичность остатков в петле антикодона вместе с модификацией i6A / t6A в положении 37 играет ключевую роль в распознавании и модификации серил- и треонил-тРНК. в образовании m3C дрожжевым ферментом Trm140 ^17,25 . В сочетании с исследованиями взаимодействия тРНК, описанными выше, эти наблюдения предполагают возможность того, что DALRD3 распознает специфические тРНК аргинина, частично, через элементы последовательности в петле антикодона, которые включают положения 36 и 37 для облегчения METTL2A-зависимого метилирования.

a Петли антикодона изоакцепторов тРНК-аргинина человека и известные модификации. b Антикодоновые петли тРНК-Arg-CCU, транскрибированной in vitro, и варианты, использованные в c , d . c , d Анализ удлинения праймера тРНК-Arg-CCU и вариантов, инкубированных с водой, векторным контрольным элюатом, очищенным METTL2A или METTL2B, коэкспрессируемым с DALRD3.Длина праймера 23 нт. e Количественная оценка образования m3C в d . Анализ удлинения праймера выполняли более трех раз для c и повторяли три раза для d . Столбцы представляют собой стандартное отклонение от среднего. Статистический анализ выполнялся с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а значимость рассчитывалась с использованием критерия множественного сравнения Тьюки. ** P <0,01. P = 0,0034 для WT по сравнению с C32A, 0,0039 для WT по сравнению с U36G, 0.0037 для WT по сравнению с A37G. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали метилтрансферазную активность комплексов METTL2-DALRD3, очищенных из клеток человека, на транскрибированных субстратах тРНК-Arg-CCU in vitro. Для мониторинга образования m3C мы использовали анализ удлинения праймера, в котором присутствие m3C приводит к блоку обратной транскриптазы (RT) в положении 32, в то время как отсутствие m3C позволяет считывать и генерировать расширенный продукт. В качестве контроля, чтобы гарантировать, что метилирование происходит в правильном положении, мы протестировали субстрат тРНК-Arg-CCU, в котором C32 был мутирован на A (C32A).Чтобы исследовать потребность в положениях 36 и 37 в метилировании METTL2-DARLD3, мы генерировали субстраты тРНК-Arg-CCU U36G и A37G (рис. 4b).

В качестве положительного контроля мы выполнили удлинение праймера на РНК, полученной из клеток 293T человека, что привело к остановке удлинения в положении 32 тРНК-Arg-CCU, что указывает на модификацию m3C, которая отсутствовала, когда не добавляли RT (рис. 4c). , полосы 1 и 2). Блок RT в положении 32 не был обнаружен для транскрибированной тРНК-Arg-CCU in vitro при предварительной инкубации с водой или очисткой отрицательного контроля (рис.4c, дорожки 3 и 4). Напротив, предварительная инкубация тРНК-Arg-CCU с очищенным METTL2A или 2B с DALRD3 или без него, с последующим удлинением праймера, выявила появление блока RT в положении 32, указывающего на образование m3C (рис. 4c, дорожки 5– 8). Мы отмечаем, что METTL2A / B, очищенный из клеток человека без сверхэкспрессии DALRD3, проявлял активность модификации m3C, что согласуется с совместной очисткой эндогенного DALRD3 с избыточно экспрессируемым METTL2A или 2B с образованием активного комплекса метилтрансферазы.Таким образом, очищенный комплекс METTL2-DALRD3 активен для образования m3C на транскрибируемом in vitro субстрате тРНК без каких-либо других модификаций.

Используя варианты tRNA-Arg-CCU, мы не обнаружили блока RT, когда C32 был мутирован в A, что свидетельствует о том, что положение 32 было сайтом метилирования (Fig. 4d, полосы 1–4). Примечательно, что мутации либо U36, либо A37 в остаток G в tRNA-Arg-CCU приводили к значительному снижению образования m3C (Fig. 4d, полосы 5-10, количественно в 4e). Эти исследования предоставляют доказательства того, что DALRD3 служит фактором различения для распознавания различных тРНК аргинина на основе элементов последовательности, общих для тРНК-Arg-CCU и тРНК-Arg-UCU.

m3C для образования клеточных тРНК аргинина требует DALRD3

Вышеприведенные результаты предполагают, что DALRD3 участвует в распознавании и взаимодействии специфических аргининовых тРНК с METTL2A / B. Чтобы исследовать потребность в DALRD3 в образовании m3C in vivo, мы сконструировали линии клеток человека, лишенные DALRD3, с использованием редактирования гена CRISPR / Cas9. Используя линию гаплоидных клеток человека HAP1 ⁴² , мы создали клон клетки, содержащий делецию 14 пар оснований в экзоне 1 гена DALRD3 (дополнительный рис.4а). Предполагается, что при делеции образуется усеченный DALRD3, в котором отсутствует большая часть полипептида, или сдвиг рамки считывания, который приводит к бессмысленному распаду (NMD). Действительно, иммуноблоттинг выявил отсутствие полноразмерного белка DALRD3 в линии клеток с нокаутом DALRD3 (D3-KO) по сравнению с изогенной контрольной линией клеток дикого типа (WT) (фиг. 5a). Хотя экспрессия DALRD3 была отменена в клеточной линии D3-KO, никаких изменений в уровнях METTL2A не было обнаружено между клеточными линиями WT или D3-KO (дополнительный рис.4б).

a Проверка иммуноблотом потери экспрессии DALRD3 в линиях клеток с нокаутом DALRD3 (KO) человека по сравнению с клетками HAP1 человека дикого типа. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Звездочкой обозначена неспецифическая полоса, обнаруженная как в лизатах клеток дикого типа, так и в клеточных лизатах D3-KO. b Схема анализа положительной гибридизации в отсутствие модификации (PHA). c Нозерн-блоттинг зондов PHA, предназначенных для обнаружения m3C в позиции 32, и контрольного зонда, который гибридизуется с другой областью той же тРНК. d Анализ удлинения праймера тРНК-Arg-UCU и Arg-CCU, собранных из обозначенных линий клеток HAP1 человека. Длина грунтовок; тРНК-Arg-UCU, 24 нуклеотида; тРНК-Arg-CCU, 23 н. и Анализ удлинения праймера тРНК-Ser-UGA и Thr-AGU, собранных из обозначенных линий клеток HAP1 человека. Длина грунтовок; тРНК-Сер-УГА, 23 нуклеотида; тРНК-Thr-AGU, 20 н. f Схема вариантов DALRD3, используемых в экспериментах по спасению DALRD3. г Иммуноблот-анализ, подтверждающий экспрессию вариантов DALRD3 в указанных клеточных линиях HAP1. ч. Анализ удлинения праймера тРНК-Arg-CCU из клеточных линий WT или D3KO HAP1, стабильно интегрированных с указанными экспрессирующими конструкциями DALRD3. (-RT) означает, что обратная транскриптаза не добавлялась; м3С-3-метилцитидин; D-дигидроуридин; t6A-треонилкарбамоладенозин; > маркированный зонд. i Количественная оценка образования m3C в тРНК-Arg-CCU путем удлинения праймера. n = 3. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего. Статистический анализ выполнялся с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а значимость рассчитывалась с использованием критерия множественного сравнения Тьюки.**** P <0,0001; нс, не имеет значения. P = 0,7430 для штамма WT + вектор по сравнению со штаммом D3-KO + WT-DALRD3. a , ( c по e ), g , h были повторены по три раза каждый с аналогичными результатами. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Чтобы контролировать образование m3C в тРНК, мы использовали положительную гибридизацию в отсутствие модификации (PHA) анализ (рис. 5b) ^43,44,45,46 . Этот анализ на основе Нозерн-блоттинга основан на дифференциальной гибридизации зонда с тРНК, вызванной присутствием или отсутствием m3C, что нарушает спаривание оснований ^47,48,49 .Таким образом, уменьшение модификации m3C приводит к увеличению сигнала зонда PHA, который может быть нормализован относительно сигнала зонда из другой области той же тРНК, что и внутренний контроль. Для тРНК-Arg-CCU и UCU мы наблюдали значительное увеличение сигнала зонда PHA в линии клеток D3-KO человека по сравнению с WT, что указывает на потерю модификации m3C в этих конкретных тРНК (рис. 5c). Напротив, не было обнаружено увеличения сигнала PHA ни для тРНК-Ser-UGA, ни для тРНК-Thr-AGU в клеточной линии D3-KO, что согласуется с субстратной специфичностью DALRD3, показанной выше.Мы также отмечаем, что стационарные уровни всех протестированных тРНК оставались сходными между клеточными линиями WT и D3-KO, включая тРНК-Arg-CCU и UCU.

В качестве дополнительной проверки мы отслеживали образование m3C в конкретных клеточных тРНК с помощью анализа удлинения праймера. Как и ожидалось, остановка RT, указывающая на m3C в положении 32 тРНК-Arg-CCU и Arg-UCU, была обнаружена в клетках 293T и HAP1 человека дикого типа (фиг. 5d). Напротив, блок m3C как в тРНК-Arg-CCU, так и в Arg-UCU был значительно снижен в клеточной линии D3-KO с последующим считыванием на следующую модификацию, блокирующую RT (рис.5г, полосы HAP1-D3KO). В соответствии с ролью DALRD3 только в модификации аргинина тРНК, модификация m3C в тРНК-Ser-UGA и Thr-AGU не затрагивается в клеточной линии D3-KO (Fig. 5e). Эти результаты демонстрируют, что DALRD3 необходим для эффективного образования m3C в определенных тРНК аргинина.

Чтобы вскрыть области DALRD3, которые играют роль в образовании m3C, мы проверили способность вариантов DALRD3 восстанавливать образование m3C в линии клеток HAP1-D3KO. Мы создали стабильные клеточные линии, экспрессирующие варианты DALRD3 или DALRD3 дикого типа, лишенные домена DALR или N-концевого удлинения (рис.5f, WT, ΔDALR и ΔNterm). Экспрессию каждого варианта DALRD3 в стабильных клеточных линиях подтверждали иммуноблоттингом (фиг. 5g). Как и ожидалось, клетки HAP1-D3KO с одним вектором не демонстрировали остановки m3C в положении 32 в тРНК-Arg-CCU по сравнению с клетками HAP1-WT (фиг. 5h, сравните дорожки 1 и 2). Повторная экспрессия DALRD3 дикого типа в клетках HAP1-D3KO способна спасти образование m3C в тРНК-Arg-CCU, о чем свидетельствует повторное введение блока m3C RT и отсутствие продуктов считывания (рис.5h, дорожка 3). Напротив, экспрессия мутанта DALRD3, лишенного домена DALR или N-концевого удлинения, была неспособна восстановить образование m3C в тРНК-Arg-CCU (фиг. 5h, дорожки 4 и 5; количественно в 5i). В целом, эти результаты демонстрируют, что образование m3C в положении 32 в специфических аргининовых тРНК требует белка DALRD3, в котором как домен DALR, так и N-концевой участок вносят вклад в ключевые роли в активности метилтрансферазы.

Влияние модификации m3C на экспрессию репортера кодона

Известно, что взаимодействие между нуклеотидами 32 и 38 антикодоновой петли тРНК влияет на распознавание кодонов и связывание тРНК с рибосомой в Escherichia coli ¹⁵ .Таким образом, мы исследовали возможные эффекты модификации m3C ₃₂ на функцию тРНК-Arg в синтезе белка с использованием кодон-зависимых репортерных конструкций. Мы создали лентивирусные репортеры, экспрессирующие белок нанолюциферазы, слитый ниже десяти последовательных кодонов AGA или AGG, которые декодируются m3C-содержащей тРНК-Arg-UCU или CCU (дополнительный рис. 5а). Мы также создали репортерные плазмиды, содержащие ряды кодонов CGA или CGC, которые декодируются с помощью тРНК-Arg-UCG или ACG, лишенных m3C. Основываясь на этой системе, мы не обнаружили значительных различий в экспрессии белка между клеточными линиями WT или D3-KO для любого из репортеров кодонов аргинина (дополнительный рис.5б и в). Мы также не обнаружили серьезных изменений в экспрессии контрольной конструкции GFP между клеточными линиями WT и D3-KO (дополнительные рис. 5b и c). Эти результаты предполагают, что модификация m3C оказывает минимальное влияние на эффективность трансляции в этих кодонах-репортерах и / или играет роль в тРНК аргинина, которую невозможно обнаружить с помощью этой экспериментальной системы.

Вариант

Из-за возникающих связей между модификацией тРНК и процессами развития нервной системы мы затем исследовали, связан ли DALRD3 с какими-либо неврологическими расстройствами неизвестной генетической этиологии.Мы определили кровнородственную семью с двумя пациентами-братьями и сестрами, демонстрирующими глубокую глобальную задержку развития и стойкую раннюю инфантильную эпилепсию, которые дали отрицательный результат на известные мутации болезни по стандартному кариотипу, хромосомному микрочипу и панели генов эпилепсии (рис. 6а). Семья была идентифицирована путем применения подхода «сначала геномика» к не охарактеризованным пациентам с нарушениями развития нервной системы ⁵⁰ . Родители — здоровые двоюродные братья и сестры, у них есть еще один здоровый ребенок в дополнение к двум больным детям и одному самопроизвольному выкидышу (рис.6б). Последующее секвенирование экзома под контролем аутозигомного анализа ⁵¹ выявило единственную гомозиготную нуклеотидную замену, приводящую к трансверсии С на А в экзоне 9 гена DALRD3 в общей области аутозиготности между двумя затронутыми братьями и сестрами на хромосоме 3 (рис. 6c). ). Подтверждающее секвенирование по Сэнгеру подтвердило полную сегрегацию этого варианта с заболеванием в семье на полностью пенетрантной аутосомно-рецессивной модели, гомозиготной у обоих пациентов и гетерозиготной у родителей и здорового брата или сестры (рис.6г). Ожидается, что генетическое изменение вызовет бессмысленную мутацию из-за введения стоп-кодона UAA в транскрипт мРНК, кодирующий преобладающую изоформу DALRD3 (pTyr417 *). Трансляция этого транскрипта приведет к усеченному белку, лишенному антикодон-связывающего домена тРНК DALR. Кроме того, мРНК варианта DALRD3 может быть подвержена NMD из-за присутствия преждевременного стоп-кодона.

a Родословная семьи, несущей бессмысленную мутацию в гене DALRD3 . b Пациенты 1 и 2 (P1 и P2), содержащие гомозиготную мутацию DALRD3 . c Гибкая мультиидеограмма анализа автозиготности исследуемой семьи в виде серии блочных дуг с двумя затронутыми людьми, представленными двумя внешними дугами. Аутозиготные области пораженных индивидуумов отмечены бледно-голубым цветом, участки здоровых индивидуумов — розовым, а гомозиготные участки всех пораженных особей — темно-синим. d Секвенирование по Сэнгеру хроматограмм указанных индивидуумов из семьи в этом исследовании наряду с контрольным индивидуумом дикого типа.

Чтобы определить молекулярное влияние мутации DALRD3 на образование m3C, мы генерировали линии лимфобластоидных клеток (LCL) от двух братьев и сестер (называемых D3-LCL, полученные от пациентов 1 и 2; P1 и P2). LCL, полученные от пораженных пациентов, сравнивали с контрольными лимфобластами от двух этнически сопоставимых, здоровых, неродственных лиц (LCL-WT1 и WT2).В соответствии с нонсенс-мутацией, приводящей к усечению белка DALRD3 и / или NMD, уровни полноразмерного белка DALRD3 были снижены в клеточных лизатах, приготовленных из LCL любого пациента, по сравнению с WT-LCL (фиг. 7a). Используя вышеупомянутый анализ PHA, мы обнаружили существенное увеличение сигнала PHA для тРНК-Arg-CCU и UCU в D3-LCL по сравнению с контрольными клетками дикого типа, что указывает на потерю модификации m3C в этих конкретных тРНК (рис. 7b). Последующее исследование с использованием анализа удлинения праймеров подтвердило серьезное снижение модификации m3C в тРНК-Arg-CCU и UCU обоих D3-LCL от пораженных пациентов (рис.7в, г). Напротив, уровни модификации m3C, обнаруживаемые с помощью гибридизации зонда PHA или удлинения праймера для tRNA-Ser-UGA и tRNA-Thr-AGU, были сходными между D3- и WT control-LCLs (Fig. 7b-d). Дефицит модификации m3C в тРНК аргинина обоих LCL пациентов демонстрирует, что мутация DALRD3 представляет собой аллель частичной потери функции.

a Иммуноблоттинг указанных белков из лизатов, полученных из LCL, полученных от индивидуумов дикого типа (WT) и пациентов P1 и P2, несущих гомозиготную мутацию DALRD3. Звездочки (*) представляют собой неспецифические полосы по обе стороны от белка DARLD3. Блоттинг был повторен дважды с аналогичными результатами. b Нозерн-блот-анализ с использованием зондов PHA, предназначенных для обнаружения m3C в позиции 32, и контрольного зонда, который гибридизуется с другой областью той же тРНК. Блоттинг был повторен трижды с сопоставимыми результатами. c Анализ удлинения праймера указанных тРНК из обозначенных человеческих LCL. (-RT) не представляет собой обратную транскриптазу; m3C 3-метилцитидин; D дигидроуридин; t6A треонилкарбамоладенозин. > маркированный зонд. Анализ удлинения праймера линий лимфобластоидных клеток повторяли трижды. d Количественная оценка образования m3C удлинением праймера для указанных тРНК. n = 2. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Эпилептические энцефалопатии (ЭЭ) охватывают большую, разнородную группу расстройств нервного развития с ранним началом, характеризующихся трудноизлечимыми припадками и аномалиями электроэнцефалограммы (см. ^52,53 ). У обоих пациентов с мутацией DALRD3 начало приступов произошло в раннем младенчестве в возрасте от 6 до 7 месяцев, что свидетельствует о раннем начале эпилептической энцефалопатии (таблица 1). В то время как эпилепсия пациента 2 могла контролироваться противоэпилептическими препаратами, приступы у пациента 1 плохо контролировались лекарствами. В дополнение к задержке развития и эпилепсии у обоих пациентов наблюдался ряд неврологических и физиологических симптомов, включая тяжелые двигательные и речевые фенотипы, гипотонию и лицевую дисморфию (Таблица 1).Основываясь на совокупности симптомов, характеризующихся одновременным возникновением задержки развития и частой эпилептической активности, оба пациента соответствуют клиническим состояниям, которые теперь классифицируются как энцефалопатия развития и эпилептическая энцефалопатия ⁵⁴ . В целом, эти данные позволяют идентифицировать людей, у которых отсутствует модификация m3C тРНК аргинина, и выявляют биологическую связь между модификацией m3C тРНК и правильной неврологической функцией.

Катионные переносчики аминокислот и Salmonella Typhimurium ArgT совместно регулируют доступность аргинина для внутриклеточного роста сальмонелл

Abstract

Катионные переносчики аминокислот (mCAT1 и mCAT2B) регулируют доступность аргинина в макрофагах. Остается понять, как в инфицированной клетке патоген может изменить метаболизм аргинина в организме хозяина. Мы раскрываем здесь новый механизм, с помощью которого Salmonella используют mCAT1 и mCAT2B для приобретения аргинина хозяина для собственного внутриклеточного роста в антигенпрезентирующих клетках.Мы демонстрируем, что Salmonella , инфицированные макрофагами и дендритными клетками костного мозга, демонстрируют повышенное поглощение аргинина и повышенную экспрессию mCAT1 и mCAT2B. Мы показываем, что транспортер mCAT1 находится в непосредственной близости от Salmonella , содержащей вакуоль (SCV), специфически живой внутриклеточной Salmonella для доступа к цитозольному пулу аргинина макрофагов. Кроме того, было обнаружено, что ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1, маркер SCV, колокализуется с mCAT1 в инфицированной клетке Salmonella .Затем внутривакуолярная Salmonella приобретает аргинин хозяина через свой собственный транспортер аргинина, ArgT, для роста. Нокаутный штамм argT был неспособен к приобретению аргинина хозяина, и его рост был ослаблен как в макрофагах, так и в модели инфекции на мышах. Вместе эти данные раскрывают стратегии выживания, с помощью которых вирулентные сальмонеллы адаптируются к суровым условиям, преобладающим в инфицированных клетках-хозяевах.

Образец цитирования: Дас П., Лахири А., Лахири А., Сен М., Айер Н., Капур Н. и др.(2010) Катионные переносчики аминокислот и Salmonella Typhimurium ArgT коллективно регулируют доступность аргинина для внутриклеточного роста Salmonella . PLoS ONE 5 (12): e15466. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466

Редактор: Нияз Ахмед, Хайдарабадский университет, Индия

Поступила: 6 августа 2010 г .; Одобрена: 24 сентября 2010 г .; Опубликовано: 3 декабря 2010 г.

Авторские права: © 2010 Das et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Положение (2A) Десятый план (191 / MCB) от директора Индийского института науки, Бангалор, Индия, и Департамента биотехнологии (DBT 197 и DBT 172), Индия. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Salmonella — это грамотрицательные факультативные внутриклеточные бактерии, которые могут инфицировать широкий спектр животных-хозяев через зараженную пищу или воду. Штаммы брюшного тифа, такие как Salmonella enterica, сероваров Typhi и Paratyphi, инфицируют людей, вызывая опасное для жизни системное заболевание, называемое брюшным тифом. С другой стороны, нетифоидные штаммы, такие как Salmonella, Typhimurium и Enteritidis, имеют более широкий круг хозяев и у людей могут вызывать острый гастроэнтерит [1]. Salmonella обладает уникальной способностью выживать и размножаться в макрофагах, и это свойство важно для ее способности вызывать системную инфекцию [2]. Чтобы преодолеть и выжить во враждебной среде, преобладающей внутри макрофагов, Salmonella разработала стратегии, позволяющие избежать врожденных и адаптивных иммунных механизмов хозяина. Оксид азота (NO) и активные формы кислорода являются центральным компонентом врожденного иммунитета хозяина и эффективным противомикробным средством против внутриклеточных патогенов.Однако выживаемость Salmonella в макрофагах свидетельствует о том, что патоген развил механизмы, позволяющие избежать этих иммунных ответов хозяина [3].

Активность iNOS зависит от наличия аргинина. Следовательно, количество аргинина, присутствующего в клетке-хозяине, и способность хозяина и патогена приобретать аргинин могут играть важную роль в формировании судьбы любой инфекции [4]. Аргинин является важным модулятором иммунного ответа хозяина [5], [6].Было показано, что захват аргинина из внеклеточной среды необходим для iNOS-зависимой продукции NO [7]. Давно известно, что классическая активация макрофагов мыши приводит к усилению транспорта аргинина [8]. Было задокументировано несколько систем транспорта аргинина млекопитающих, включая системы y ⁺ , B ⁰⁺ , b ⁰⁺ и y ⁺ L [9]. Транспорт на базальном уровне в неактивированных макрофагах происходит через систему y ⁺ L, а в активированных макрофагах — через систему y ⁺ .Семейство переносчиков катионных аминокислот (CAT) принадлежит к системе y ⁺ и включает четыре члена с CAT1 по 4, кодируемых Slc7A1 с по — 4 генами. Аргинин переносится первыми тремя членами семейства переносчиков катионных аминокислот [10]. CAT1 экспрессируется повсеместно, за исключением печени, тогда как CAT3 экспрессируется только в головном мозге. CAT2 имеет два варианта сплайсинга, из которых CAT2A экспрессируется в клетках печени и гладких мышц, а CAT2B — в макрофагах [8].

Интересно, что захват аргинина необходим не только для макрофагов хозяина, но и для возбудителя инфекции.Известно, что несколько патогенов изменяют метаболизм аргинина внутри клеток-хозяев как с патогенной, так и с клеточной точки зрения [11], [12]. Например, внутриклеточная Listeria активирует экспрессию гена arpJ , который является пермеазой аргинина, однажды в организме хозяина [13]. Mycobacterium marinum индуцирует ген argS , который кодирует аргинил-тРНК-синтетазу [14]. Giardia lamblia подавляет продукцию NO внутри макрофагов хозяина, потребляя весь аргинин высокоэффективной транспортной системой аргинина [15].В случае Salmonella наличие системы транспорта аргинина хорошо задокументировано. Таким образом, можно ожидать, что для выживания в жестких условиях питания, преобладающих в клетках-хозяевах, Salmonella может также транспортировать и использовать аргинин-хозяин для лучшего роста и выживания.

Следовательно, наш интерес состоял в том, чтобы определить, может ли внутриклеточная Salmonella приобретать аргинин макрофагов для роста и тем самым снижать доступность цитозольного аргинина для продукции NO.Целью настоящей работы было изучение влияния инфекции Salmonella на пул аргинина хозяина. Мы наблюдали, что Salmonella действительно может получать доступ к цитозольному аргининовому пулу макрофагов и использовать его для синтеза белка, используя как хозяин, так и его эндогенные переносчики аргинина.

Результаты

Известно, что после активации различными стимулами макрофаги увеличивают захват аргинина [11].Аргинин — это важная аминокислота, которая определяет судьбу многих инфекций, регулируя продукцию NO, опосредованную iNOS. Поэтому мы решили определить влияние инфекции Salmonella на способность АРС к транспорту аргинина. Мы измерили транспортную активность BMDM у мышей BALB / c через 12 часов заражения Salmonella . На рис. 1А показано, что инфекция Salmonella привела к заметному увеличению способности BMDM к поглощению аргинина. Чтобы еще больше подтвердить наш результат, мы исследовали общую популяцию клеток печени и селезенки контрольных и инфицированных мышей BALB / c.Как и ожидалось, клетки печени и селезенки инфицированных мышей показали в 3 раза большее поглощение аргинина по сравнению с клетками неинфицированных контрольных мышей (фиг. 1B). Затем мы проверили способность DC к поглощению аргинина, выделенных из мышей BALB / c.

Рисунок 1. Salmonella активирует транспорт аргинина в макрофагах, полученных из костного мозга (BMDM), в печени, селезенке и дендритных клетках мышей.

( A ) BMDM были инфицированы WT Salmonella при MOI 10, а анализ поглощения аргинина проводили через 12 часов после заражения ( B ). 10 ⁶ КОЕ штамма WT и вскрытие через 5 дней после заражения.Неинфицированных (UI) мышей лечили PBS. Клетки печени и селезенки инфицированных мышей или мышей UI подвергали анализу поглощения аргинина. Представленные данные являются одним из трех подобных экспериментов. Статистическая значимость была определена следующим образом: **, P <0,01 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g001

Чтобы определить механизм, с помощью которого инфекция Salmonella привела к увеличению поглощения аргинина BMDM, общая РНК была выделена из Salmonella инфицированных и неинфицированных BMDM, полученных от мышей BALB / c, для количественного определения мРНК mCAT1 и mCAT2B.Базовая экспрессия мРНК mCAT1 и mCAT2B наблюдалась в неинфицированных BMDM. Однако инфицирование Salmonella в течение 12 часов привело к значительному увеличению мРНК mCAT1 (в 5 раз) и mCAT2B (в 3 раза) по сравнению с неинфицированными макрофагами (рис. 2A – B). Наши результаты согласуются с гипотезой о том, что инфекция сальмонеллы увеличивает поглощение аргинина за счет увеличения экспрессии этих двух переносчиков.

Рисунок 2. Инфекция Salmonella в макрофагах, полученных из костного мозга (BMDM), увеличивает экспрессию мышиного переносчика катионных аминокислот 1 (mCAT1) и мышиного переносчика катионных аминокислот 2 (mCAT2B).

( A ) BMDM инфицировали WT Salmonella при MOI 10, а уровни мРНК mCAT1, mCAT2B и β-actin исследовали с помощью полуколичественной RT-PCR через 12 часов после заражения. ( B ) На графике нанесено среднее кратное увеличение транскрипции mCAT1 и mCAT2B после заражения из трех независимых экспериментов после денситометрического анализа и нормализации с β-актином . Уровни сравниваются между инфицированными и неинфицированными макрофагами из этих экспериментов.Статистическая значимость была определена следующим образом: * P <0,05 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g002

Мы предположили, что Salmonella использует аргинин хозяина для роста. Затем мы пошли дальше, чтобы проверить, как патоген усваивает аргинин хозяина. Мы предположили, что специфический переносчик аргинина в бактериальной мембране может транспортировать аргинин хозяина к бактериям.Чтобы доказать это, мы исследовали роль связывающего лизин-аргинин-орнитин периплазматического белка ArgT, кодируемого геном argT (STM 2355). Другими генами, присутствующими в том же опероне, являются hisP и hisMQ , которые кодируют АТФ-связывающий компонент и два интегральных мембранных компонента, соответственно, транспортера лизин / аргинин / орнитин ABC и транспортера гистидина ABC E. coli [16] — [18]. Биоинформатический анализ баз данных неизбыточных белков показал, что несколько пермеаз аргинина как непатогенных, так и патогенных бактерий имеют значительную гомологию с Salmonella ArgT (данные не показаны).

Чтобы проверить, экспрессируется ли белок ArgT внутриклеточной Salmonella , мы сделали удар в штамме, в котором 6 гистидин были помечены на С-конце хромосомного белка ArgT. Мы наблюдали только одну единственную полосу 27 кДа, принадлежащую меченному гистидином белку ArgT. Как было проверено с помощью вестерн-блоттинга, контрольный лизат Salmonella не приводит к образованию какого-либо другого меченного гистидином белка любого размера. Тот же штамм использовали для заражения BMDM, и через 12 часов заражения бактерии очищали и лизировали.Этот белок использовали для измерения количества белка ArgT, экспрессируемого внутриклеточной сальмонеллой . Те же бактерии, выращенные в LB в течение 12 ч, использовали в качестве контроля. Сравнивая количество белка RRF, экспрессируемого во внутриклеточном штамме Salmonella и LB, выращенном Salmonella из нокаутного штамма, мы наблюдали, что белок ArgT активируется примерно в 2–3 раза после инфицирования (рис. 3A – B). Штамм WT был использован в качестве отрицательного контроля, чтобы показать, что Salmonella не содержит в себе белка, меченного гистидином.

Фигура 3. ArgT экспрессируется внутриклеточной Salmonella .

( A ) Показана экспрессия His-меченного белка ArgT в LB, выращенном и из изолированного ArgT :: His, нокаут в бактериях из инфицированного BMDM после выполнения SDS PAGE. У контрольных бактерий WT нет ни одного белка, меченного His такого же размера. Зондирование фактора рециркуляции рибосом (RRF) было выполнено для выравнивания количества бактериального белка, загруженного для SDS PAGE ( B ). Среднее кратное увеличение уровня белка ArgT после инфицирования в течение 12 часов по сравнению с бактериями, выращенными LB из трех независимых были нанесены на график эксперименты после денситометрического анализа и нормализации с использованием фактора рециклинга рибосом (RRF).Статистическая значимость была определена следующим образом: * P <0,05 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g003

Чтобы выяснить функцию argT , мы сделали нокаут одного гена в WT Salmonella и подтвердили мутацию штамма различными наборами праймеров. . Штамм не имел дефектов роста ни в минимальных средах LB, ни в M9 (данные не показаны). Емкость поглощения аргинина штамма WT и Δ argT Salmonella затем проверяли in vitro с использованием радиоактивного аргинина.Данные, представленные на фиг. 4A, ясно демонстрируют, что бактерии Δ argT не способны поглощать экзогенный аргинин, как штамм WT. Штамм комплемента (c- argT) ведет себя аналогично штамму WT. Для дальнейшего понимания судьбы производного от хозяина аргинина в Salmonella in vivo мы инфицировали BMDM от мышей BALB / c штаммами WT, Δ argT или c- argT в среде DMEM, не содержащей аргинина. После инфицирования в течение 25 минут добавляли ¹⁴ C-аргинин.Через 12 часов инфицирования мы изолировали внутриклеточные бактерии из инфицированных клеток, и бактерии помещали в чашку с антибиотиками для подсчета количества бактерий, присутствующих в различных штаммах. После получения данных КОЕ количество бактерий было нормализовано для различных образцов, и дублированные лунки были использованы для дальнейших экспериментов. Целый бактериальный белок после нормализации был загружен в SDS-страницу, и сканирование с помощью фосфорного сканера изображения было выполнено через 12 часов воздействия. Белковый профиль штамма WT содержал значительное количество радиоактивно меченного аргинина, что указывает на то, что бактерии использовали цитозольный пул аргинина хозяина для своей собственной трансляции.Однако штамм Δ argT не включал радиоактивно меченый аргинин хозяина (фиг. 4B, верхняя панель). Комплементарный штамм argT показал профиль белка, подобный штамму WT. Равную загрузку белков подтверждали вестерн-блоттингом белка фактора рециклинга рибосом (RRF) Salmonella (фиг. 4B, средняя панель). Контаминация белка-хозяина была исключена путем проведения вестерн-блоттинга на β-актин). Данные, представленные на фиг. 4B, нижняя панель показывают, что белок-хозяин эффективно удаляется из образцов, поскольку только в положительном контроле лизата BMDM имеется полоса β-актина.

Рисунок 4. Salmonella используют аргинин хозяина для синтеза белка.

( A ) Анализ поглощения аргинина выполняли с 10 ⁸ номерами WT, Δ argT и argT дополненным штаммом (c- argT) на поздней стационарной фазе роста. ( B ) Верхняя панель . BMDM, поддерживаемые в DMEM без аргинина, были инфицированы либо WT, Δ argT , либо штаммом, дополненным argT (c- argT) .Через 25 мин заражения к клеткам добавляли меченый радиоактивным изотопом аргинин. После 12 ч инфицирования равные количества выделенных бактериальных белков из 10 ⁹ бактерий были загружены на страницу SDS. Гель выдерживали в кассете в течение 12 часов, и включенную радиоактивность оценивали сканированием фосфорного формирователя изображения. Средняя панель , Равная загрузка бактерий во всех образцах была подтверждена проведением вестерн-блоттинга против фактора рециркуляции рибосом (RRF). Нижняя панель , Клеточное загрязнение в образцах проверяли с помощью вестерн-блоттинга β-актина.В положительном контроле с лизатом BMDM наблюдалась только специфическая полоса для актина. Статистическая значимость была определена следующим образом: **, P <0,01, **, P <0,01 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g004

ArgT является важным детерминантом вирулентности

Мы подозревали, что неспособность использовать цитозольный аргинин хозяина может препятствовать выживанию Δ argT Salmonella внутри макрофагов.В соответствии с нашей гипотезой, у BMDM кратность репликации WT была 9-кратной от 2 до 12 часов, тогда как кратность репликации штамма Δ argT была только 3-кратной. Штамм c-argT рос так же, как и штаммы WT (фиг. 5A). Затем мы исследовали роль argT в выживании Salmonella in vivo . После заражения мышей BALB / c штаммом WT или штаммом Δ argT мы проанализировали бактериальную нагрузку в селезенке и печени.После 5 дней инфицирования бактериальная нагрузка штамма Δ argT была значительно меньше в селезенке и печени по сравнению со штаммом WT (рис. 5B – C). Бактериальная нагрузка штамма c- argT была почти равна штамму WT ​​в селезенке. Однако в печени штамм c- argT не рос точно так же, как штамм дикого типа, но вирулентность значительно снижалась по сравнению с штаммом с нокаутом. Вместе эти данные предполагают, что argT является важной детерминантой вирулентности Salmonella .Снижение бактериальной нагрузки штамма Δ argT in vivo может быть связано с усилением NO-ответа макрофагов в случае инфекции Δ argT , а также из-за неспособности штамма Δ argT усваивать аргинин хозяина. пул для перевода.

Фигура 5. Δ argT Salmonella аттенуирована на вирулентность и демонстрирует сниженную бактериальную пролиферацию in vivo .

( A ) Анализ внутриклеточной выживаемости.BMDM были инфицированы при 10 MOI с помощью WT, Δ argT или штамма, дополненного argT (c- argT) . Инфицированные макрофаги лизировали через 2 и 16 ч после инфицирования, и количество бактерий определяли в трех повторностях. 1 × 10 ⁶ бактерий, каждый из штаммов WT или Δ argT или штамма комплемента argT ( c-argT ), инокулировали перорально группе из 6 мышей-самцов BALB / c. После 5 ^-го дня инфицирования гомогенизированные образцы ( B ) селезенки, ( C ) печени инфицированных мышей помещали на чашки с антибиотиками и подсчитывали колонии.Представленный результат является одним из трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была определена следующим образом: *, P <0,05, **, P <0,01 (критерий Манна-Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g005

Кроме того, нитритный ответ инфицированных макрофагов в случае инфекции Δ argT был значительно выше по сравнению с инфицированными клетками дикого типа (рис. 6А), указывая на то, что аргинин, доступный для синтеза NO в инфицированных Δ argT клетках, больше.В BMDM штамм argT ослаблен в 3 раза по сравнению со штаммом WT. Чтобы исключить, зависело ли это увеличение ответа NO от меньшего количества бактерий в BMDM, инфицированных Δ argT , мы провели тот же эксперимент, используя более высокий MOI 30 для штамма Δ argT . В этих условиях также клетки, инфицированные штаммом Δ argT , продуцировали повышенный уровень нитрита в супернатанте. Чтобы понять, может ли большее количество аргинина усилить ответ макрофагов на NO, мы инфицировали макрофаги сальмонеллой дикого типа при различной концентрации аргинина.Данные, представленные на фиг. 6В, показывают, что увеличение концентрации аргинина в культуральной среде с 0,5 до 1 мМ действительно усиливало реакцию NO инфицированных WT клеток макрофагов. Однако дальнейшее повышение уровня L-аргинина с 1 мМ до 2 мМ не повлияло на продукцию нитрита. Таким образом, повышенный NO-ответ макрофагов, инфицированных Δ argT Salmonella , может быть связан с большей доступностью аргинина для iNOS для синтеза NO.

Рисунок 6. Инфицирование штаммом Δ argT в BMDM вызывает высокий ответ NO.

( A ) BMDM были инфицированы при 10 MOI с WT, Δ argT или штаммом, дополненным argT (c- argT ), а также 30 MOI из Δ argT и Комбинированный штамм argT (c- argT ) штамм. Продукция нитрита определялась в культуральных супернатантах инфицированных BMDM по реакции Грисса через 12 часов после инфицирования. ( B ) BMDM поддерживали в концентрации L-аргинина 0,5, 1,0, 1,5 или 2,0 мМ и инфицировали WT Salmonella в течение 12 часов.Продукция нитрита определялась в культуральных супернатантах реакцией Грисса. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение одного из трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях. Статистическая значимость была определена следующим образом: * P <0,05 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g006

Механизм захвата цитозольного аргинина внутриклеточными

Затем мы исследовали механизм, с помощью которого внутриклеточный Salmonella получает доступ к цитозольному пулу аргинина хозяина.Мы проверили совместную локализацию mCAT1 с внутриклеточными Salmonella в BMDM с помощью конфокальной микроскопии. Мы наблюдали, что mCAT1 хозяина, который экспрессируется исключительно в клеточной мембране в неинфицированных макрофагах, предпочтительно рекрутируется внутриклеточной Salmonella в инфицированных BMDM. Мы продолжили проверять рекрутирование mCAT1 внутриклеточной Salmonella в различные моменты времени после заражения. Для этого мы инфицировали макрофаги WT-GFP Salmonella в разные промежутки времени (рис.7A, 8A) и наблюдали, что локализация mCAT1 в SCV начинается через 3-4 часа после инфицирования. Мы также иммуноокрашивали инфицированную клетку на LAMP1, который является маркером SCV, чтобы окончательно продемонстрировать паттерн локализации переносчиков CAT-хозяина. Мы наблюдали значительную совместную локализацию жизнеспособного WT Salmonella (зеленый) и белка mCAT1 (красный) через 4 ч (фиг. 7C) и 12 ч (фиг. 8C) инфекции, вызывая желтый цвет. Белок LAMP1 (синий) также значительно колокализуется с бактериями (зеленый) в оба момента времени, генерируя голубой цвет (рис.7B, 8B), указывая на присутствие LAMP1 в SCV. В оба момента времени 80–90% бактерий имели голубой цвет. Наши данные показывают, что белок mCAT также рекрутируется в LAMP1, содержащую вакуоль, вызывая пурпурный (данные не показаны) цвет в инфицированной клетке. Коэффективность совместной локализации общего синего (LAMP1) с красным (mCAT1), давшего начало пурпурному цвету, составляет около 26% через 4 часа заражения. Эта совместная локализация увеличивается до 57% через 12 часов заражения, что ясно указывает на тот факт, что Salmonella постоянно рекрутирует белок mCAT1 в SCV.Точно так же после инфицирования в течение 12 часов количество mCAT1 и бактериальной колокализации увеличивается по сравнению с 4-часовым заражением, что ясно указывает на то, что рекрутинг является активным. В нескольких областях было подсчитано количество бактерий, совместно локализованных с белком mCAT1. Это было сделано путем деления количества бактерий, имеющих желтые пятна, на общее количество бактерий из различных областей и нескольких экспериментов. 4 часа заражения Salmonella в BMDM позволили 35% от общего числа Salmonella приобрести mCAT1.12 ч инфицирования позволили почти 75% бактерий из общего числа внутриклеточных бактерий рекрутировать mCAT1 (рис. 8E). Наблюдали три вида совместной локализации, а именно совместную локализацию пятен, частичную совместную локализацию или полную совместную локализацию бактерий с белком mCAT1 (рис. 7C, вставки 8C). Совместная локализация LAMP1 и mCAT1 в GFP Salmonella указывает на то, что переносчики аргинина хозяина присутствуют в очень близкой вязкости с SCV. Это приводит к появлению одних и тех же бактерий, имеющих иммуноокрашивание как LAMP, так и mCAT1, и белого цвета, если все три находятся в одной и той же области.Увеличенные бактерии показаны на вставках (рис. 7D, 8D). Этот эксперимент ясно указывает на то, что переносчики аргинина хозяина рекрутируются внутриклеточными Salmonella в их вакуоли.

Рисунок 7. Внутриклеточная Salmonella начинает колокализоваться с mCAT1 хозяина в BMDM в ранний момент инфицирования.

BMDM были инфицированы WT Salmonella в течение 4 часов. Сайты колокализации выявляли путем иммуноокрашивания антителом против mCAT1 и вторичным антителом, конъюгированным с Cy5, а также с антителом против LAMP1 и вторичным антителом, конъюгированным с Cy3.Окрашивание Cy3 имело псевдо-синий цвет. Образцы были проанализированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, и показаны репрезентативные изображения для определения местоположения BCG-GFP (зеленый), mCAT1 (красный) и LAMP1 (синий). ( A ) Репрезентативное изображение для локализации WT-GFP (зеленый) в полутоновом изображении. ( B ) Изображение для локализации WT-GFP (зеленый) и LAMP1 (синий). Колокализация дает голубой цвет. Врезка: увеличенное изображение бактерий, содержащих вакуоль.( C ) Изображение для локализации CAT1 (красный) и WT-GFP (зеленый). Колокализация дает желтый цвет. Врезка: увеличенное изображение бактерий, содержащих вакуоль. ( D ) Изображение для локализации CAT1 (красный), WT-GFP (зеленый) и LAMP1 (синий). Совместная локализация LAMP1 и mCAT1 в GFP Salmonella дает начало тем же бактериям, имеющим иммуноокрашивание как LAMP, так и mCAT1, увеличенные бактерии показаны на вставках.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0015466.g007

Рис. 8. Внутриклеточная Salmonella колокализуется с mCAT1 хозяина в BMDM в поздний момент инфицирования.

BMDM инфицировали WT Salmonella в течение 12 часов и окрашивали, как описано ранее. ( A ) Репрезентативное изображение для локализации WT-GFP (зеленый) в полутоновом изображении. ( B ) Изображение для локализации WT-GFP (зеленый) и LAMP1 (синий). Колокализация дает голубой цвет.Врезка: увеличенное изображение бактерий, содержащих вакуоль. ( C ) Изображение для локализации CAT1 (красный) и WT-GFP (зеленый). Колокализация дает желтый цвет. Врезка: увеличенное изображение бактерий, содержащих вакуоль. ( D ) Изображение для локализации CAT1 (красный), WT-GFP (зеленый) и LAMP1 (синий). Это дает начало тем же бактериям, имеющим иммуноокрашивание как LAMP, так и mCAT1, увеличенные бактерии показаны на вставках. Колокализация трех цветов дает белый цвет.( E ) Процент совместной локализации WT Salmonella с mCAT1 через 4 (белая полоса) и 12 ч (черная полоса) после заражения. Совместная локализация (%) WT-GFP Salmonella с mCAT1 наносится на график после подсчета из 50 полей в трех независимых экспериментах. Из общего числа бактерий в этих полях подсчитывали количество желтых бактерий и наносили на график совместную локализацию (%). Также показано количество LAMP1, совместно локализованного с белком mCAT1. Для этой цели подсчитывалась эффективность совместной локализации синего, который совместно локализовался с красным и давал пурпурный цвет.Статистическая значимость была проверена путем сравнения значений 4 часов со значениями 12 часов, определенными следующим образом: * P <0,05 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g008

Чтобы лучше понять, используется ли этот механизм другими внутриклеточными бактериями, мы проверили колокализацию mCAT1 во внутриклеточную Mycobacterium bovis BCG. Интересно, что в BMDM, инфицированных M. bovis BCG, также было обнаружено, что mCAT1 значительно колокализуется с внутриклеточной BCG (рис.9А). Напротив, никаких признаков колокализации не было отмечено для погибших от тепла мертвых Salmonella в BMDM через 12 часов инфекции (рис. 9B), что ясно указывает на то, что привлечение mCAT1 является стратегией выживания живой и вирулентной Salmonella и не зависит от Salmonella LPS. BMDM, инфицированные непатогенной кишечной палочкой , показали значительно меньшую колокализацию с mCAT1, что указывает на то, что это рекрутирование является стратегией вирулентности патогенных бактерий (рис.9C). Латексные шарики GFP также показали резко сниженный образец совместной локализации (фиг. 9D). В случае Mycobacteria инфицированных клеток 70% бактерий из общего числа бактерий, подсчитанных во многих областях, совместно с белком mCAT1, в то время как тепло убило Salmonella , E.coli или клетки, содержащие бусинки, имели только 10–20% бактерий. общее количество бактерий или шарик, совместно локализованный с белком mCAT1 (фиг. 9E).

Рисунок 9. Характер распределения mCAT1 в BMDM после инфицирования различными другими патогенами или состояниями.

( A ) Внутриклеточный M. bovis BCG (GFP) колокализуется с белком mCAT1 хозяина в BMDM через 12 часов после инфицирования. Сайты колокализации выявляли путем иммуноокрашивания антителом против mCAT1 и вторичным антителом, конъюгированным с Cy5. Образцы были проанализированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, и показаны репрезентативные изображения для определения местоположения BCG-GFP (зеленый) и mCAT1 (красный). Врезка: увеличенное изображение области, содержащей бактерии. ( B ) Убитый нагреванием Salmonella (GFP) через 12 часов заражения BMDM показан зеленым, а mCAT1 показан красным.Окрашивание производили, как описано ранее. ( C ) BMDMS инфицировали штаммом dh5a E.coli (GFP) при MOI 10 в течение 12 ч и окрашивали, как описано ранее. ( D ) BMDM позволяли фагоцитировать инертные латексные шарики (GFP, соотношение 1-25) и фиксировали через 12 часов после фагоцитоза. Окрашивание производили, как описано ранее. ( E ) Процент совместной локализации BCG, убитых нагреванием Salmonella (HK), E.coli или гранул GFP (Beads) с mCAT1 наносят на график после подсчета из 50 полей в трех независимых экспериментах.Из общего количества бактерий / гранул в этих полях подсчитывали общее количество желтых бактерий / гранул, наносили на график совместную локализацию (%) и проверяли значимость после сравнения любой группы со значениями совместной локализации GFP-гранул. Статистическая значимость была определена следующим образом: * P <0,05 (критерий Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015466.g009

Обсуждение

Аргинин является важным регулятором врожденного иммунного ответа хозяина [5], [6].Есть два основных транспортера аргинина в клетках млекопитающих [8], и сообщалось, что из них mCAT2B необходим для устойчивого производства NO в макрофагах [19]. Опубликованные отчеты предполагают, что лечение LPS и IFNγ [20] или другое патогенное вмешательство [21] может увеличивать экспрессию транспортеров аргинина mCAT1 и mCAT2B. Предыдущие исследования показали, что выживаемость M. bovis [22], Taxoplasma [23], Trypanosoma [24] и Leishmania [25], [26] внутри макрофагов зависит от их способности вмешиваться. с метаболическим путем аргинина хозяина.Мы предположили, что внутриклеточная Salmonella может использовать цитозольный аргинин хозяина для экономии собственных затрат энергии. Кроме того, нас в основном интересовал транспорт аргинина, поскольку эта аминокислота является единственным субстратом для выработки NO хозяином, который, в свою очередь, может убить патогенную Salmonella . Мы показали, что после 12 часов заражения Salmonella в BMDM мРНК mCAT1 и mCAT2B, а также захват аргинина были значительно повышены по сравнению с неинфицированными клетками.Клетки печени и селезенки мышей, инфицированных Salmonella , также показали повышенное поглощение аргинина. Мы также наблюдали, что даже в дендритных клетках Salmonella инфекция приводила к увеличению поглощения аргинина.

Мы предположили, что внутриклеточная Salmonella может получить доступ к цитозольному пулу аргинина хозяина путем рекрутирования переносчика аргинина с клеточной мембраны на мембрану SCV. Наши конфокальные данные ясно продемонстрировали, что внутриклеточная Salmonella рекрутирует переносчик аргинина хозяина mCAT1 к бактериям, содержащим вакуоль.Находясь в инфицированных клетках, мы иммуноокрашивали на mCAT1 и LAMP1. Сразу после инвазии особи Salmonella обнаруживаются в дискретных вакуолях, характеризующихся временным присутствием ранних эндоцитарных маркеров на мембране [27]. Через 5-10 минут после инвазии эти белки заменяются ассоциированными с лизосомами мембранными белками (LAMP), которые накапливаются дальше в течение многих часов [28]. LAMP1 является известным маркером SCV [29], и наши данные показали, что более 90% всех бактерий были колокализованы с LAMP1.Мы также наблюдали, что белок mCAT1 рекрутируется в SCV. Через 4 часа после заражения около 35% всех бактерий колокализуются с mCAT1. В поздний момент заражения этот процент увеличивается до 75%, что указывает на то, что этот процесс вербовки является активным. Мы также наблюдали, что белок mCAT1 и LAMP1 находятся в непосредственной близости в инфицированной клетке, и совместная локализация активно увеличивается с инфекцией. С одной стороны, совместная локализация mCAT1 с бактериями, а с другой стороны, совместная локализация mCAT1 с ранее известным маркером SCV LAMP1 ясно указывает на тот факт, что переносчики аргинина хозяина рекрутируются в SCV.Это дает начало тем же бактериям, имеющим иммуноокрашивание как на LAMP, так и на mCAT1. Интересно, что это рекрутирование mCAT1 не проявляется убитыми нагреванием Salmonella или непатогенными E.coli или латексными шариками. Таким образом, измененный транспорт mCAT1, по-видимому, является активным процессом, опосредованным живыми патогенными бактериями, и не зависит от LPS. Данные, представленные на рис. 7–9, ясно показывают, что в случае Bead E.coli или убитые нагреванием бактерии инфицировали BMDM; mCAT1 хозяина локализован на мембране.Однако в случае заражения Salmonella наблюдается четкое перераспределение. В инфицированной клетке мембрана, а также SCV содержат значительное количество переносчика аргинина хозяина. Тот факт, что подобный фенотип наблюдался с внутриклеточным M. bovis BCG, увеличивает важность этого нового открытия. Поскольку предыдущие исследования показали, что в случае инфекции БЦЖ наблюдается явное увеличение поглощения аргинина хозяином и уровня экспрессии переносчиков аргинина хозяином.Кроме того, роль гена M. bovis BCG, gabP хорошо известна в поглощении аргинина хозяина внутриклеточной BCG [12]. Наше исследование предоставляет первое свидетельство того, что переносчик аргинина хозяина mCAT1 действительно задействован во внутриклеточной БЦЖ. Мы хотели проверить, участвует ли CAT2B в SCV после заражения Salmonella . Однако из-за отсутствия коммерческих антител мы не смогли провести конфокальные исследования. Чтобы преодолеть эту проблему, мы сконструировали конструкцию кДНК-GFP мышиного гена CAT2B и трансфицировали в BMDM.Мы наблюдали совместную локализацию белка GFP с SCV после заражения Salmonella , что указывает на то, что CAT2B также играет важную роль в передаче аргинина хозяина бактериям (данные не показаны). Однако из-за слияния белка GFP с мембранным транспортером CAT2B возникла проблема в свойстве белка перекрывать мембрану. Мы наблюдали диффузный паттерн экспрессии конструкции CAT2B :: GFP по всей клетке.

Мы также предположили, что внутривакуолярный Salmonella использует свой эндогенный транспортер аргинина для транспортировки аргинина из цитозоля хозяина внутрь SCV.В соответствии с нашей гипотезой, мы наблюдали очень важную роль периплазматического связывающего белка аргинина, ArgT, в патогенезе Salmonella . Было обнаружено, что белок ArgT активируется при инфицировании BMDM, что указывает на его роль во внутриклеточном выживании Salmonella. Как отмечалось ранее [30], мы также обнаружили, что этот белок не подвергается сильной активации при инфекции, поскольку этот ген также играет роль в выживании in vitro. Нокаут argT Salmonella был значительно ослаблен в BMDM и на мышиной модели инфекции, что позволяет предположить тот факт, что ArgT является основным переносчиком аргинина в Salmonella , необходимым для приобретения аргинина хозяина, и является важным маркером вирулентности.При инфицировании Δ argT в BMDM ответ NO хозяина был значительно выше по сравнению с Salmonella дикого типа , что позволяет предположить, что этот транспорт также является механизмом снижения продукции NO хозяином путем секвестрации аргинина с пути iNOS. Чтобы еще больше проверить этот момент, мы добавили возрастающее количество L-аргинина во время инфицирования BMDMs сальмонеллой WT . Как наблюдалось ранее [31], продукция NO из инфицированных макрофагов значительно увеличивалась после изменения концентрации L-аргинина с 0.От 5 до 1 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации L-аргинина не оказало дополнительного влияния на продукцию NO, поскольку концентрация субстрата для iNOS могла достигнуть предела насыщения. Чтобы изучить судьбу аргинина хозяина в патогенезе Salmonella , мы проследили включение радиоактивно меченного аргинина хозяина в организм дикого типа и Δ argT Salmonella . Фосфорный имидж-сканер показал, что Salmonella дикого типа использует радиоактивно меченый аргинин хозяина для синтеза собственного белка. Δ argT Salmonella не смог использовать аргинин хозяина для своей трансляции.Насколько нам известно, это исследование впервые продемонстрировало, что внутриклеточная Salmonella использует аргинин хозяина для выживания в антигенпредставляющих клетках, таких как BMDM и DC. Интересно, что это поглощение аргинина хозяина внутриклеточной Salmonella может быть использовано для специфической доставки меченных аргинином антибиотиков к патогену, обеспечивая лучшее уничтожение. Несомненно, клетка-хозяин увеличивает поглощение аргинина в ответ на ЛПС во время инфекции Salmonella , чтобы увеличить активность iNOS и продукцию NO для контроля патогена.Однако Salmonella подрывает этот защитный механизм хозяина и использует этот дополнительный аргинин для своей собственной трансляции.

В заключение, увеличение переносчиков аргинина хозяином в ответ на инфекцию Salmonella является механизмом врожденного иммунитета, первоначально предназначенным для увеличения продукции NO хозяином. Однако наши данные свидетельствуют о том, что этот врожденный иммунный ответ, направленный на борьбу с инфекцией, используется патогеном для его собственной трансляции. Вкратце, инфекция Salmonella увеличивает переносчики аргинина, и переносчики локализуются в SCV.Все эти механизмы приводят к поглощению аргинина бактериями. Таким образом, Salmonella активирует переносчики аргинина хозяина и использует дополнительный аргинин. Таким образом, Salmonella подавляет аргинин от пути iNOS. Кроме того, бактерии получают аргинин для собственного синтеза белка без дополнительных затрат. Энергетическое преимущество этой патогенной стратегии предполагает, что, возможно, могут быть и другие переносчики аминокислот, которые также активируются.Однако мы не обсуждали их здесь, поскольку они выходят за рамки наших исследований. Лучшее понимание потребности патогена в питательных веществах даст важные ключи к дальнейшему пониманию этого вопроса. Выяснение эффекторов Salmonella , вовлеченных в измененный трафик переносчиков аргинина хозяина, требует дальнейших исследований. Наши данные показывают, что меченый аргинином антибиотик может способствовать специфической и направленной доставке любого антибиотика к внутриклеточным Salmonella и Mycobacteria , обеспечивая лучшее уничтожение.В инфицированной клетке меченый аргинином антибиотик может достигать патогена, содержащего вакуоль, посредством перемещенных переносчиков аргинина хозяина и может оказаться очень эффективным.

Материалы и методы

Заявление об этике

Вся работа с животными проводилась в соответствии с утвержденным Институтом этическим протоколом. Номер этики CAF / ETHICS / 189/2010.

Бактериальные штаммы, среды и условия роста

Устойчивый к налидиксовой кислоте дикий тип (WT) S.enterica серовар Typhimurium штамм 12023 использовали в качестве родительского штамма для конструирования нокаута и для всех других экспериментов (подарен профессором М. Хензелем, Германия). Он вирулентен на мышиной модели инфекции. Культуру дикого типа выращивали при 37 ° C в бульоне Луриа в налидиксовой кислоте (50 мкг / мл), Δ argT Salmonella в канамицине (50 мкг / мл) и дополняли штамм Δ argT в ампициллине (50 мкг / мл). мл). Убитый нагреванием Salmonella получали нагреванием бактериальной культуры при 80 ° C в течение 20 минут.

Получение макрофагов из костного мозга (BMDM)

Как описано ранее [32], бедренные кости собирали у мышей в асептических условиях и промывали костный мозг. Клетки поддерживали в среде DMEM с добавлением 30% среды, кондиционированной клетками L929, 10% инактивированного нагреванием FBS, 2 мМ l-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. При анализе сортировки клеток с активацией флуоресценции наблюдалось, что клетки были> 90% CD11b-положительными. Линия клеток L929 была любезным подарком проф.M.S.Shaila, Отдел микробиологии, Индийский институт науки, Бангалор, Индия.

Культура клеток и бактериальная инфекция

поддерживали в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Sigma), с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (Sigma). Как описано ранее [33], штаммы Salmonella были добавлены к клеткам макрофагов, растущим в 24-луночных планшетах для культивирования тканей при множественности инфицирования (MOI) 10.Бактерии центрифугировали на клетках при 500 × g в течение 10 мин. После инфицирования в течение 25 мин клетки трижды промывали PBS и инкубировали в течение 1 ч в среде для культивирования клеток, содержащей 50 мкг / мл гентамицина (Sigma). Среду заменяли средой, содержащей гентамицин с концентрацией 10 мкг / мл, до конца эксперимента. В другой серии экспериментов клетки были истощены по аргинину путем культивирования в среде без аргинина (Hi-media) в течение 72 часов и использовались для последующих исследований с добавлением ¹⁴ C-L-аргинина (BARC, Индия, 0.1 мКи / мл).

Для подсчета внутриклеточных бактерий макрофаги трижды промывали PBS и лизировали 0,1% Triton X-100 в течение 10 мин, и серийные разведения наносили на чашки с агаром LB.

M. bovis BCG Pasteur 1173P2 выращивали до средней логарифмической фазы в среде Сутона. Пакетные культуры разделяли на аликвоты и хранили при -70 ° C. Типичные флаконы размораживали и подсчитывали количество жизнеспособных колониеобразующих единиц на агаре Миддлбрук 7h20 (Difco) с добавлением OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза).Одноклеточные суспензии бактерий получали с помощью коротких импульсов обработки ультразвуком. Бактерии использовали при 10 MOI для инфекции, как описано ранее [34].

Определение концентрации нитрита

(NO ₂ ^—) в супернатантах культивируемых макрофагов использовали в качестве индикатора продукции NO и измеряли реакцией Грисса с нитритом натрия в качестве стандарта для расчета количества продуцируемого нитрита. 50 мкл супернатанта инкубировали с 50 мкл раствора, содержащего дигидрохлорид N- [нафтил] этилендиамина (NED) (0.01%) и 50 мкл раствора, содержащего сульфаниламид (0,1%) в 5% фосфорной кислоте, в течение 10 мин. Затем измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Полуколичественная ОТ-ПЦР

BMDM засевали в количестве 1 × 10 ⁶ на лунку в шестилуночные планшеты и инфицировали при 10 MOI бактериями WT. Через 12 ч заражения суммарную РНК выделяли с помощью реагента TRIzol (Sigma). Впоследствии 2 мкг РНК из каждого образца подвергали обратной транскрипции с использованием «набора PROMEGA RT». Один цикл ПЦР состоял из следующего: 94 ° C в течение 1 мин, 60 ° C в течение 1.5 мин и 72 ° C в течение 2 мин. Для mCAT1 использовали следующие праймеры: прямой, 5′-caa caa tag gac caa aac acc c-3 ‘и обратный, 5′-cga aga tgc tca aga cag gaa g-3’. Для mCAT2B использовали следующие праймеры: прямой, 5′-tca att cca aaa cga aga cac cag ta — 3 ‘и обратный, 5′-ag tca aaa aga aag gcc atc aca-3’. Аналогичным образом, для β-актина мыши : прямого, 5′-tgg aat cct gtg gca tcc a-3 ‘и обратного использовали праймеры 5′-taa cag tcc gcc tag aag ca-3’.

Анализ поглощения аргинина в BMDM