Протеинов: Виды протеинов и их различия в спортивном питании — интернет-магазин Чиф и Шериф

Рис. 1: Взаимосвязь между боковыми цепями аминокислот и конформацией белка

Определяющим признаком аминокислоты является ее боковая цепь (вверху, синий кружок; внизу, все цветные кружки). Когда аминокислоты соединяются серией пептидных связей, они образуют полипептид, другое слово для обозначения белка. Затем полипептид сворачивается в определенную конформацию в зависимости от взаимодействий (пунктирные линии) между его боковыми аминокислотными цепями.

Рисунок 2: Структура белка бактериородопсина

Бактериородопсин — это мембранный белок бактерий, который действует как протонная помпа. Его форма важна для его функции. Общая структура белка включает как альфа-спирали (зеленый), так и бета-листы (красный).

Окончательная форма, принятая вновь синтезированным белком, обычно является наиболее энергетически выгодной.Когда белки сворачиваются, они тестируют множество конформаций, прежде чем достичь своей окончательной формы, которая является уникальной и компактной. Сложенные белки стабилизируются тысячами нековалентных связей между аминокислотами. Кроме того, химические силы между белком и его непосредственным окружением способствуют формированию и стабильности белка. Например, белки, растворенные в цитоплазме клетки, имеют на своей поверхности гидрофильные (водолюбивые) химические группы, тогда как их гидрофобные (водоотталкивающие) элементы имеют тенденцию скрываться внутри.Напротив, белки, которые вставлены в клеточные мембраны, демонстрируют некоторые гидрофобные химические группы на своей поверхности, особенно в тех областях, где поверхность белка подвергается воздействию липидов мембран. Однако важно отметить, что полностью свернутые белки не замораживаются. Скорее, атомы в этих белках остаются способными совершать небольшие движения.

Несмотря на то, что белки считаются макромолекулами, они слишком малы, чтобы их можно было визуализировать даже в микроскоп.Итак, ученые должны использовать косвенные методы, чтобы выяснить, как они выглядят и как сложены. Наиболее распространенным методом исследования структуры белков является рентгеновская кристаллография . С помощью этого метода твердые кристаллы очищенного белка помещаются в пучок рентгеновских лучей, а диаграмма отклоненных рентгеновских лучей используется для прогнозирования положений тысяч атомов в кристалле белка.

белков и экспрессия генов | Изучайте науку в Scitable

Через призму клеточной биологии изучение экспрессии генов тесно связано с нашим пониманием белков.Начиная с ранних работ Кристиана Анфинсена в 1950-х годах, мы знаем, что последовательность аминокислот в белке определяет его окончательную трехмерную структуру. Исходя из этого, ученые неоднократно наблюдали, что структура белка определяет, где он будет действовать и что он будет делать. Нигде это не было так очевидно, как с функцией ферментов. Форма и структура белков — это важный аспект биологии экспрессии генов, который связывает наше понимание экспрессии генов с биологией клетки.Хотя в первую очередь речь идет о белковых молекулах, которые действуют на последовательности ДНК и РНК, таких как факторы транскрипции и гистоны, изучение экспрессии генов также сосредоточено на том, где в клетке модулируется экспрессия. Фактически, модуляция экспрессии генов может происходить в ядре, цитоплазме или даже на клеточной мембране из-за воздействия белков на РНК в этих клеточных субрегионах.

Как ученые изучают форму и функцию белка? Метод, называемый масс-спектрометрией, позволяет ученым определять последовательность аминокислот в белке.После того, как последовательность известна, сравнение ее аминокислотной последовательности с базами данных позволяет ученым определить, существуют ли связанные белки, функция которых уже известна. Часто аналогичные аминокислотные последовательности будут выполнять аналогичные функции в клетке. Аминокислотная последовательность также позволяет ученым предсказать заряд молекулы, ее размер и вероятную трехмерную структуру. Позже заряд и размер могут быть подтверждены экспериментально (с помощью SDS-PAGE и двухмерных гелей). Чтобы понять сложности трехмерной структуры, ученые попытаются кристаллизовать белок, чтобы подтвердить его молекулярную структуру с помощью рентгеновской кристаллографии и / или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (pNMR).

Как ученые изучают влияние белков на гены или другие белки? Хороший способ изучить функцию белка — посмотреть, что происходит в клетке, когда белок отсутствует. Для этого ученые используют модельные системы, такие как культура клеток или целые организмы, в которых они могут тестировать функцию определенных белков или генов, изменяя или мутируя их. Уровень экспрессии гена может быть рассчитан путем измерения транскрибированной мРНК (нозерн-блот), экспрессированного белка (вестерн-блот) или путем прямого окрашивания белка или мРНК, когда они все еще находятся в клетке.Новые методы изменили способ изучения экспрессии генов — микроматрицы ДНК, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) и высокопроизводительное секвенирование позволяют проводить более широкий анализ нескольких молекул одновременно и открывают возможность для новых и более широких видов вопросов. Чтобы проанализировать большие наборы данных и увидеть, как взаимодействуют сети молекул, новая дисциплина, называемая системной биологией, обеспечивает основу для этого более широкого и интегрированного понимания регуляторных сетей.

Интересно, что белки — не единственные регуляторы генов.Регуляторные молекулы имеют форму РНК и действуют на другие нуклеиновые кислоты, изменяя или разрушая их. Одним из примеров является семейство рибопереключателей, молекул рибонуклеиновой кислоты, которые образуют трехмерные структуры, которые останавливают транскрипцию или препятствуют ей при наличии надлежащего внешнего сигнала. Другой пример РНК, действующей на другие РНК, — это механизм РНК-интерференции (РНКи), при котором молекулы двухцепочечной РНК разлагают мРНК перед трансляцией, таким образом эффективно препятствуя экспрессии белка.Рассмотрение этого механизма и его последующее экспериментальное имитация было благом для тех, кто заинтересован в манипулировании функцией генов.

В конечном счете, результаты такого рода исследований имеют фундаментальное значение, от базового понимания нормальных функций клеток, таких как дифференциация, рост и деление клеток, до разработки принципиально новых подходов к лечению заболеваний. Фактически, некоторые заболевания человека могут возникать просто из-за дефекта трехмерной структуры белка.Изучая экспрессию генов и белков, легко увидеть, как мелкие изменения на молекулярном уровне имеют реверберирующий эффект.

Изображение: Библиотека биохимических алгоритмов.

Chem4Kids.com: Биохимия: Белки

3D Proteins: The Big Picture (Видео США-NSF)

Однокомпонентные самособирающиеся белковые наночастицы, представляющие рецептор-связывающий домен и стабилизированный шип в качестве кандидатов на вакцину против SARS-CoV-2

ВВЕДЕНИЕ

Три коронавируса (CoV) вызвали массовые вспышки среди людей, включая тяжелый острый респираторный синдром CoV -1 (SARS-CoV-1), CoV с ближневосточным респираторным синдромом (MERS-CoV) и SARS-CoV-2, который является возбудителем заболевания CoV 2019 (COVID-19) ( 1 — 3 ) и привел к более чем 2.4 миллиона смертей во всем мире ( 4 ). Огромные усилия предпринимаются для разработки эффективных терапевтических и профилактических средств от SARS-CoV-2. Небольшие молекулы, которые могут блокировать рецептор хозяина, ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) и трансмембранную протеазу серин 2 (TMPRSS2) ( 5 ), которая необходима для обработки белка спайка, рассматриваются в качестве лечения в дополнение к прочие вмешательства ( 6 ). В то время как иммунология, лежащая в основе COVID-19, все еще интенсивно изучается ( 6 — 8 ), различные вакцины-кандидаты в настоящее время находятся в стадии клинической разработки ( 9 — 12 ).Инактивированные вирусные вакцины продемонстрировали устойчивые ответы нейтрализующих антител (NAb) у животных ( 13 , 14 ), тогда как вирусные векторные вакцины на основе аденовируса человека (Ad5 и Ad26) и ChAdOx1 шимпанзе оценивались на нечеловеческих приматах и ​​в испытаниях на людях ( 15 — 18 ). Как ДНК ( 19 — 21 ), так и мРНК ( 22 , 23 ) вакцины были быстро разработаны, при этом умеренные титры NAb наблюдались для мРНК вакцины в группах средних и высоких доз ( 22 ). .Рекомбинантный спайковый белок с адъювантом липидных наночастиц (НЧ), NVX-CoV2373, вызывал высокие титры NAb в испытании на людях, которые в среднем были в четыре раза выше, чем у выздоравливающих пациентов ( 24 , 25 ). Недавно сообщалось об эффективности векторной вакцины (AZD1222: 70,4%) ( 26 ) и двух вакцин с мРНК (мРНК-1273: 94,1%; BNT162b2: 95%) ( 27 , 28 ). В декабре 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) двух мРНК-вакцин.

Спайковый белок SARS-CoV-2 представляет собой тример гетеродимеров S1-S2. Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который связывается с ACE2 на клетках-хозяевах, чтобы инициировать инфекцию. Субъединица S2 состоит из гибридного пептида (FP) и областей 1 и 2 гептадных повторов (HR1 и HR2). При эндоцитозе вириона субъединица S1 отщепляется, чтобы облегчить вставку FP в мембрану клетки-хозяина, в то время как оставшаяся часть S2 повторно складывается, чтобы объединить HR1 и HR2 для слияния мембран вируса и клетки-хозяина ( 29 ).Спайковый белок содержит все эпитопы NAb и является основной мишенью для разработки вакцины против SARS-ассоциированных CoV ( 30 ). Плазма выздоравливающих использовалась для лечения пациентов с COVID-19 с тяжелыми состояниями ( 31 ), что подчеркивает важность NAb для защиты ( 32 ). Из-за умеренной консервации последовательности RBD (~ 73%) было показано, что некоторые ранее идентифицированные NAb, нацеленные на RBD SARS-CoV-1, связываются и перекрестно нейтрализуют SARS-CoV-2 ( 33 , 34 ).Используя одноклеточные технологии и SARS-CoV-2 RBD или спайк в качестве приманки, сильнодействующие NAb были изолированы от пациентов с COVID-19 ( 35 — 41 ). Одноцепочечные NAb, происходящие от верблюдовых, также были получены путем пэннинга библиотек наивных или иммунных однодоменных антител ламы (V _H H) ( 42 , 43 ). Структуры спайка SARS-CoV-2 и RBD в нелигандированных ( 44 , 45 ), связанных с ACE2 ( 46 — 48 ) и связанных с антителами ( 49 — 51 ) состояниях определенные методами рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) проложили путь к рациональному дизайну вакцины.Крио-ЭМ и криоэлектронная томография (ЭТ) выявили врожденную метастабильность спайков и сосуществование спайков до / после слияния на вирионах ( 52 ). Мутация с двойным пролином ( 52 ) использовалась в большинстве конструкций растворимых шипов (S2P) и во всех вакцинах, кроме инактивированных, хотя сейчас доступна версия HexaPro с более высоким выходом и стабильностью ( 53 ). Cryo-ET также обнаружил динамический трехшарнирный стержень HR2, который облегчает проникновение вируса и уклонение от иммунитета ( 54 — 56 ).

В этом исследовании мы разработали и оптимизировали антигены SARS-CoV-2 для поливалентного отображения на самособирающихся белковых NP (SApNP) ( 57 — 59 ), включая 24-мерный ферритин (FR) и два 60 -меры (E2p и I3-01v9), содержащие внутренний слой блокирующих доменов (LD) и кластер «Т-клеточных» эпитопов ( 60 ). Чтобы облегчить очистку вакцин без меток, мы разработали иммуноаффинную колонку на основе антитела CR3022, которое связывается с обоими RBD SARS-CoV-1/2 ( 34 , 50 ).Сначала мы разработали конструкцию тримера RBD, имитирующую конформацию шипа RBD-up. RBD SARS-CoV-1/2 были прикреплены к SApNP с помощью системы SpyTag / SpyCatcher ( 61 ), что обеспечило надежную стратегию разработки NP-вакцин на основе RBD. Затем мы исследовали метастабильность спайка, сравнивая два нерасщепленных антигена спайка, S2P (K986P / V987P) и S2G (K986G / V987G). Спайк SARS-CoV-2 S2G проявлял ненормальное поведение, предполагая, что неидентифицированная грань спайка может способствовать конформационным изменениям и блокировать доступ антител к RBD.Спайк с делецией HR2, S2GΔHR2, продуцировал тримеры высокой чистоты, предполагая, что стебель HR2 может быть триггером метастабильности спайка, что согласуется с недавними открытиями ( 54 — 56 ). Затем мы продемонстрировали S2GΔHR2 на трех SApNP путем слияния генов, в результате чего были получены спайковые SApNP с высоким выходом, чистотой и антигенностью. При иммунизации мышей спайковый белок S2P вызывал самый низкий уровень ответа NAb. Напротив, тример RBD с каркасом регистрировал в два-три раза более высокие титры NAb, с еще одним пятикратным увеличением титра NAb, достигнутым за счет поливалентного отображения на FR.S2GΔHR2 вызывал до семи раз более высокие титры NAb, в то время как большие многослойные S2GΔHR2 E2p и I3-01 SApNP вызывали до 10 раз более высокие титры NAb, чем S2P. Дальнейший анализ показал, что SApNP I3-01v9, представляющий S2GΔHR2, может вызывать сильный ответ Т-хелпера 1 (T _H 1) и другие типы ответов Т-клеток, необходимые для защитного клеточного иммунитета. Таким образом, наше исследование идентифицирует стебель HR2 как основной источник метастабильности спайков, подтверждает дизайн спайков с удаленным HR2 и предоставляет набор вирусоподобных частиц (VLP) на основе RBD и спайков в качестве эффективных кандидатов в белковые вакцины против SARS-CoV. -2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рациональная конструкция каркасных тримеров RBD и представляющих RBD SApNPs

Связывание RBD с рецептором ACE2 инициирует процесс слияния мембран ( 5 ). Кристаллическая структура комплекса SARS-CoV-2 RBD / ACE2 выявила атомные детали распознавания рецептора ( 62 ). SARS-CoV-2 RBD использовался в качестве приманки для выделения моноклональных антител (mAb) из образцов пациентов ( 35 — 41 ). Для SARS-CoV-1 и MERS-CoV вакцины на основе RBD индуцировали мощные NAb, которые эффективно блокируют проникновение вируса ( 30 ).Следовательно, RBD представляет собой главную мишень для гуморальных реакций после инфекции и может использоваться для разработки эпитоп-ориентированных вакцин.

Мы сначала предположили, что RBD, прикрепленный к тримерному каркасу, может имитировать конформацию RBD-up spike и вызывать NAb, которые блокируют связывание ACE2. Чтобы проверить эту возможность, мы разработали гибридную конструкцию, содержащую SARS-CoV-1/2 RBD, короткий 5-аминокислотный линкер G ₄ S (с сайтом рестрикции из 2-х аминокислот) и тримерный вирусный капсидный белок, SHP [Банк данных белков (PDB): 1TD0] (Рис.1А). Структурное моделирование показало, что три связанных RBD образуют треугольник 92 Å (измерено на L492), что на 14 и 18 Å шире, чем шип SARS-CoV-1 «два-RBD-up» (PDB: 6CRX, измеренный на L478). ) ( 63 ) и спайк «all-RBD-up» MERS-CoV (PDB: 5X59, измеренный для L506) ( 64 ), соответственно, обеспечивая доступ NAb к каждому RBD. Затем мы разработали колонку для иммуноаффинной хроматографии (IAC), чтобы облегчить очистку без меток. Ранее колонки IAC, полученные на основе NAb, использовались для очистки тримеров / НЧ Env ВИЧ-1 ( 58 , 59 , 65 , 66 ), ядер / НЧ E2 вируса гепатита С (HCV) ( 57 ) и тримеры / НЧ гликопротеина (GP) вируса Эбола (EBOV) ( 60 ).Тиан и др. ( 34 ) сообщил, что SARS-CoV-1 NAb, CR3022, может связывать SARS-CoV-2 RBD. Структура SARS-CoV-2 RBD / CR3022 выявила консервативный криптический эпитоп, который является общим для двух SARS-CoV, что позволяет предположить, что временные дыхательные движения спайкового белка позволили CR3022 связываться с RBD ( 50 ). Здесь мы рассмотрели полезность CR3022 в столбцах IAC. Конструкции SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-1TD0 временно экспрессировали в клетках ExpiCHO объемом 100 мл и очищали на колонке CR3022 перед эксклюзионной хроматографией (SEC) с использованием колонки Superdex 200 10/300 GL.В то время как конструкция SARS-CoV-1 RBD показывала пики агрегатов (~ 8,6 мл) и тримеров (~ 12,7 мл) в профиле SEC, конструкция SARS-CoV-2 RBD давала один чистый пик тримеров при ~ 12,8 мл ( Рис. 1Б). При электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) полоса мономера ~ 37 кДа и полоса тримеров ~ 100 кДа наблюдались в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, соответственно (рис. S1A). Антигенность была оценена для двух каркасных тримеров RBD в иммуноферментном анализе (ELISA) после очистки CR3022 / SEC (рис.1С). Специфические для RBD NAb, нацеленные на SARS-CoV-1 [CR3022 ( 67 ), m396 ( 68 ), 80R ( 69 ) и S230 ( 70 )] и SARS-CoV-2 [B38 ( 38 ), CB6 ( 37 ), S309 от выжившего после SARS ( 33 ) и P2B-2F6 ( 36 )] были протестированы в ELISA. В целом, аналогичные значения полумаксимальной эффективной концентрации (EC ₅₀ ) наблюдались для двух тримеров RBD, связывающихся с их соответствующими NAb (фиг. 1C). Тример SARS-CoV-1 RBD показал большее сродство к CR3022, чем его аналог SARS-CoV-2, с показателем 1.3-кратная разница в значениях EC ₅₀ , что согласуется с предыдущими результатами ( 34 , 50 ). Из NAb SARS-CoV-2, B38 дал такое же значение EC ₅₀ , что и CR3022, который может связывать, но не нейтрализовать SARS-CoV-2. Кинетику связывания антител измеряли с помощью интерферометрии биослоя (BLI) (рис. 1, B и D). В целом, все протестированные mAb показали высокую скорость включения, но с видимыми различиями в скорости их отклонения. B38 показал более быстрое снижение скорости, чем другие NAb SARS-CoV-2, в то время как CR3022, mAb, используемое для очистки белков RBD SARS-CoV-1/2, продемонстрировало сопоставимый кинетический профиль.

( A ) Структурная модель RBD-5GS-1TD0 в расширенном состоянии RBD-up (вид сверху и вид сбоку). 1TD0 — это тримеризационный каркас вирусного происхождения. ( B ) Профили SEC тримеров RBD, каркасных для SARS-CoV-1/2, после экспрессии ExpiCHO и очистки CR3022. УФ ₂₈₀ , поглощение ультрафиолета при 280 нм. ( C ) Связывание с помощью ELISA тримеров RBD на каркасах SARS-CoV-1/2 с панелью mAb.Значения EC ₅₀ (мкг / мл) помечены. Ab, антитело. ( D ) Связывание октета тримерного RBD на основе SARS-CoV-2 с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 950 до 29,5 нМ путем двукратных разведений. ( E ) Схема конъюгирования RBD с 24-мерным FR SApNP с использованием системы SpyTag / SpyCatcher (SPY). ( F ) Профили SEC SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-SPY-5GS-FR, полученных в ExpiCHO путем коэкспрессии (черная линия) и смеси супернатанта (красная линия).( G ) Связывание с помощью ELISA SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-FR с панелью mAb. Значения EC ₅₀ (мкг / мл) помечены. ( H ) Октетное связывание SApNP SARS-CoV-2 RBD-FR с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 37 до 1,1 нМ путем двукратных разведений. ( I ) ЭМ-изображения SARS-CoV-1 RBD-10GS-FR (слияние генов) и RBD-5GS-SPY-5GS-FR (коэкспрессия). ( J ) ЭМ-изображения SARS-CoV-2 RBD-5GS-SPY-5GS-FR, полученные путем совместной экспрессии и смеси супернатанта.( K ) Схема сопряжения RBD с 60-мерным многослойным I3-01v9 SApNP с использованием системы SPY. Изображены блокирующие домены (LD) и Т-хелперные эпитопы в многослойной SApNP. ( L и M ) Профили SEC и ЭМ изображения SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-SPY-5GS-I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P), полученные с помощью смеси супернатантов . Профили SEC каркасных тримеров RBD в (B) и SPY-связанных SApNP RBD в (F) и (L) были получены из колонки Superdex 200 10/300 GL и колонки Superose 6 10/300 GL соответственно.

Затем мы выдвинули гипотезу, что система SpyTag / SpyCatcher (названная SPY) может быть использована для конъюгирования RBD с SApNP для создания поливалентных вакцин RBD, способных вызывать более сильный ответ NAb (рис. 1E). SpyTag из 13 аминокислот спонтанно реагирует с белком SpyCatcher с образованием необратимой изопептидной связи ( 61 ). Система SPY успешно использовалась для прикрепления антигенов к VLP ( 71 ). Здесь SpyTag был слит с С-концом RBD, тогда как SpyCatcher был слит с N-концом субъединицы SApNP, оба с 5-аминокислотным линкером G ₄ S.Эта конструкция была впервые испытана для 24-мерной FR. Здесь мы сравнили две стратегии продукции, коэкспрессию RBD-5GS-SpyTag и SpyCatcher-5GS-FR по сравнению со смесью супернатанта после отдельной экспрессии, с последующей очисткой на колонке CR3022. Белок, полученный в результате временной трансфекции в 50-мл клетки ExpiCHO, анализировали с помощью SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 1F). Обе стратегии продуцирования дали пик (12 мл), соответствующий SApNP. В то время как конструкция SARS-CoV-2 превзошла своего аналога SARS-CoV-1 по выходу частиц (0.От 6 до 1,0 мг по сравнению с 0,3 до 0,5 мг после CR3022 / SEC), смесь супернатантов оказалась лучше, чем совместная экспрессия по выходу в обоих случаях. Таким образом, результаты показывают, что обе стратегии могут быть использованы для получения RBD SApNP в клетках яичника китайского хомячка (CHO) в промышленных условиях, поскольку эта экспрессионная система млекопитающих широко используется для производства терапевтических гликопротеинов в условиях надлежащей производственной практики (GMP) ( 72 , 73 ). Антигенность оценивали для SEC-очищенных SApNP RBD-5GS-SPY-5GS-FR.В ELISA RBD SApNP показали немного улучшенное связывание mAb по сравнению с тримерами RBD, на что указывают значения EC ₅₀ (фиг. 1G). В BLI наблюдалось более выраженное влияние мультивалентного дисплея на антигенность, показывая заметно увеличенные сигналы связывания и плато диссоциации (рис. 1, C и H). Структурная целостность различных RBD SApNP была проанализирована с помощью отрицательной окраски EM (nsEM) (рис. 1, I и J). Для SARS-CoV-1 генетически слитая конструкция RBD-10GS-FR продуцировала очень мало, хотя и очень чистых, SApNP (рис.1И, слева). Напротив, конструкция RBD-5GS-SPY-5GS-FR давала высокий выход SApNPs с видимыми украшениями поверхности (рис. 1I, справа). Для SARS-CoV-2 очищенные SApNP RBD-5GS-SPY-5GS-FR, независимо от производственной стратегии, показали морфологию хорошо сформированных частиц (рис. 1J). Ранее мы генетически слили небольшой белок LD и Т-клеточный эпитоп с каждой субъединицей 60-меров E2p и I3-01v9, в результате чего получили «многослойные» SApNPs ( 60 ). PADRE, 13-аминокислотный pan-DR эпитоп, который активирует CD4 ⁺ Т-клетки ( 74 ), был использован для стимулирования развития В-клеток в направлении NAb.Здесь два лучших дизайна, E2p-LD4-PADRE (или E2p-L4P) и I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P), были протестированы на их способность отображать SARS-CoV-1/2. RBDs. Следуя стратегии, установленной для FR, RBD SARS-CoV-1/2 были присоединены к I3-01v9-L7P SApNP с помощью системы SPY (рис. 1K). Несмотря на скромный выход клеток ExpiCHO (рис. 1L), на изображениях ЭМ наблюдались большие и чистые частицы (рис. 1M). Однако некоторые примеси были отмечены для представляющих RBD SApNP E2p-L4P (рис. S1D). Тем не менее, мы проиллюстрировали полезность системы SPY для быстрой разработки вакцин против SARS-CoV-1/2 RBD на основе трех различных платформ SApNP.

Недавно RBD отображались на различных SApNP, использующих систему SPY, как кандидаты на вакцины MERS-CoV и SARS-CoV-2 ( 75 , 76 ). Walls et al. ( 77 ) также сообщил о кандидате вакцины против SARS-CoV-2 RBD на основе двухкомпонентной платформы NP, для которой требуется компонент «соединитель» для облегчения сборки NP ( 78 ), что, вероятно, приводит к неоптимальной стабильности. Кроме того, все эти вакцины-кандидаты требуют сложного производственного процесса, включающего две системы экспрессии, отдельные стадии очистки и стадию сборки in vitro перед окончательной очисткой.Напротив, наши SPY-связанные RBD SApNP являются однокомпонентными по своей природе и могут быть произведены в клетках CHO с простой схемой очистки, предлагая уникальные преимущества в стабильности и технологичности.

Рациональный дизайн спайка перед слиянием за счет минимизации метастабильности

В дополнение к RBD спайки SARS-CoV-1/2 содержат другие эпитопы NAb ( 30 ), которые все представлены в тримерном контексте (рис. 2A) . Мутация двойного пролина (2P) между HR1 и центральной спиралью (CH) была использована для стабилизации спайков MERS-CoV ( 79 ) и SARS-CoV-1 ( 63 ).Похожая мутация 2P (K986P / V987P) была введена в спайк SARS-CoV-2 (названный S2P), который использовался для выделения и характеристики NAb ( 33 , 35 , 40 , 42 — 45 , 49 ) и является антигеном почти во всех вакцинах-кандидатах, находящихся в клинической разработке ( 11 , 12 ). Однако недавнее исследование крио-ЭМ выявило неожиданную упаковку S1 в шипе S2P, расположенную на ~ 12 Å наружу по сравнению с полноразмерным нативным шипом, а также более упорядоченную проксимальную область FP (FPPR) в S2 ( 52 ).Были созданы новые конструкции для контроля конформации шипа ( 80 ) или для его дальнейшей стабилизации с помощью большего количества пролинов (HexaPro) ( 53 ). Недавние исследования крио-ЭМ и крио-ЭТ показали, что шипы SARS-CoV-2 могут принимать различные ориентации на нативных вирионах из-за очень гибкой ножки HR2 ( 54 — 56 ). Ранее мы определили изгиб HR1 как причину метастабильности Env ВИЧ-1 ( 58 , 81 ) и исследовали роль эквивалентного изгиба HR1 и ножки HR2 в метастабильности EBOV GP ( 60 ).Такое понимание метастабильности оказалось критически важным для разработки стабильных тримеров и тример-презентирующих вакцин SApNP для обоих вирусов ( 58 — 60 , 81 ). Поэтому крайне важно изучить причину (ы) метастабильности спайков, чтобы облегчить разработку рациональной вакцины против SARS-CoV-2.

( A ) Структурная модель префузионного S-шипа, связанного с С-концевым доменом тримеризации (1TD0) с помощью линкера 5GS на прозрачной молекулярной поверхности.Приблизительное положение неструктурированной ножки HR2 или, в данном случае, 5-аминокислотного (а.о.) линкера G ₄ S выделено пунктирной линией. ( B ) Профили SEC шипов SARS-CoV-1 (вверху) и SARS-CoV-2 (внизу). Панели слева направо: S2P _ECTO -5GS-1TD0, очищенный на никелевых колонках и CR3022 (1 и 2), S2G _ECTO -5GS-1TD0 на никелевых колонках и CR3022 (3 и 4) и S2GΔHR2-5GS-1TD0 на колонке CR3022 (5). Все спайковые конструкции, протестированные в (B), содержат C-концевую метку His ₆ для облегчения очистки колонки с никелем.Результаты трех отдельных производственных циклов показаны для SARS-CoV-2 S2G _ECTO -5GS-1TD0. ( C ) Схематическое изображение полноразмерного шипа SARS-CoV-2 на поверхности вирусной мембраны в присутствии ACE2 хозяина и области HR2 из соседнего шипа (слева) и выравнивание последовательностей SARS-CoV-1 / 2 области HR1 и HR2 (справа, сверху и снизу). Сегменты HR1 и HR2, которые образуют пучок из шести спиралей в состоянии после слияния, выделены зеленым и коричневым оттенком соответственно.( D ) Слева: профили SEC S2GΔHR2-5GS-1TD0, показывающие результаты четырех отдельных производственных циклов. Справа: анализ BN-PAGE S2P _ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0. Фракции SEC (от 12,5 до 14,0) показаны для S2GΔHR2-5GS-1TD0 на геле. Профили SEC в (B) и (D) были получены из колонки Superose 6 10/300 GL. ( E ) Связывание с помощью ELISA двух шипов SARS-CoV-2 (S2P _ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0) с пятью mAb. Значения EC ₅₀ (мкг / мл) помечены.( F ) Связывание октетов двух шипов SARS-CoV-2 (S2P _ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0) с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 150 до 4,7 нМ путем двукратных разведений. Спайковые конструкции, испытанные в (D) — (F), не содержат C-концевую метку His ₆ .

Сначала мы создали конструкции нерасщепленного спайкового эктодомена (S _ECTO ) для SARS-CoV-1/2, обе содержащие мутацию 2P (K968P / V969P и K986P / V987P, соответственно), 5-аминокислотную G ₄ S-линкер, мотив тримеризации (PDB: 1TD0) и C-концевой His ₆ тег.Две конструкции временно экспрессировали в 50-мл клетках ExpiCHO с последующей очисткой либо на никелевой колонке, либо на колонке CR3022. Белок S2P _ECTO -5GS-1TD0-His ₆ охарактеризовали с помощью SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 2B, панели 1 и 2). После никелевой колонки обе конструкции S2P _ECTO показали пик тримеров (~ 12 мл) с левым и правым плечом, указывающими на агрегат и разновидности димера / мономера, соответственно. Очистка CR3022 привела к устойчивому пику тримеров и снижению количества димеров / мономеров.Затем мы сравнили пару конструкций S _ECTO для SARS-CoV-1/2, обе из которых содержат мутацию двойного глицина (2G), K968G / V969G и K986G / V987G, соответственно. Мутация 2G мало повлияла на спайк SARS-CoV-1, но вызвала аномальные профили SEC и не показала выхода для спайка SARS-CoV-2 после очистки на никелевых колонках и CR3022 соответственно (рис. 2B, панели 3 и 4. ). Наконец, мы протестировали пару конструкций S2G без стебля HR2 (E1150-Q1208), названных S2GΔHR2. Удаление стебля HR2 восстановило пик тримера SARS-CoV-2 и уменьшило агрегаты для обоих SARS-CoV-1/2, как показано профилями SEC после очистки CR3022 (рис.2Б, панель 5). Поскольку трехшарнирный стержень HR2 может генерировать различные ориентации шипов на нативных вирионах ( 54 — 56 ), а ядро ​​слияния образовано HR1 и HR2, мы предположили, что HR2 может быть ключевым детерминантом SARS-CoV- 2 метастабильности спайка (рис. 2С, слева). Вероятно, что взаимодействия между HR1 и HR2 двух соседних шипов могут способствовать переходу от пре- до пост-слияния в дополнение к связыванию ACE2 и диссоциации S1. Учитывая значительную разницу в последовательностях HR1 (всего 9 аминокислот) по сравнению с SARS-CoV-1 (рис.2C, справа), мы стремились изучить вклад HR1 в метастабильность спайков SARS-CoV-2 с двумя конструкциями спайков с заменой HR1 (HR1 _S ). В то время как замена HR1 оказалась неэффективной, удаление ножки HR2 снова восстановило пик тримера, что указывает на более важную роль HR2 (рис. S2, от A до C). Следовательно, S2GΔHR2, по-видимому, является общей схемой шипа для SARS-CoV-1/2 и, возможно, других CoV. Четыре отдельных прогона продукции SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-1TD0 в 300-мл клетках ExpiCHO привели к почти идентичным профилям SEC с выходами тримеров 0.От 8 до 1,0 мг (рис. 2D, слева). Соответственно, синий нативный PAGE (BN-PAGE) показал высокую чистоту тримеров во всех фракциях SEC (фиг. 2D, справа). Антигенность оценивалась для шиповых белков SARS-CoV-2 S2P _ECTO и S2GΔHR2, очищенных с помощью CR3022 / SEC. В ELISA спайк S2GΔHR2 показал немного более высокое сродство к пяти репрезентативным mAb, чем спайк S2P _ECTO (фиг. 2E). При тестировании с тремя недавно идентифицированными человеческими NAb, C105 ( 49 ) и CC12.1 / CC12.3 ( 41 ), два шипа дали аналогичные значения EC ₅₀ (рис.S2D). В BLI спайк S2GΔHR2 показал более высокие сигналы связывания, чем спайк S2P _ECTO при наивысшей концентрации, демонстрируя сходную кинетику связывания (фиг. 2F). Использование NAb P2B-2F6 ( 36 ) для спайковой очистки привело к более высокому выходу тримеров с такой же чистотой, что и на колонке CR3022 по фракциям SEC (рис. S2E). Термостабильность оценивалась методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для спайков SARS-CoV-2 S2P _{, ECTO} и S2GΔHR2, очищенных с помощью CR3022 / SEC (рис.S2F). После замены 2P на 2G и делеции HR2 наблюдалось небольшое увеличение средней точки термической денатурации ( T _m ) (46,8 ° C по сравнению с 47,6 ° C) с заметно более высокой температурой начала ( T _на ), 35,2 ° C против 40,0 ° C и более узкую полуширину пика ( Δ T _1/2 ), 4,7 ° C против 3,9 ° C. Вместе мы продемонстрировали, что ножка HR2 является основным источником метастабильности спайка, а S2GΔHR2 представляет собой альтернативный дизайн спайка по сравнению с S2P, хотя для достижения большей термостабильности может потребоваться больше стабилизирующих мутаций.

Рациональная конструкция однокомпонентных самособирающихся НЧ шипов

Хотя было возможно конъюгировать тримерные шипы SARS-CoV-2 с SApNP с помощью системы SPY ( 82 ), случайное необратимое связывание, вероятно, приведет к нерегулярный дисплей с незанятыми, но пространственно закрытыми точками крепления на поверхности. Система SPY, возможно, больше подходит для небольших индивидуальных антигенов (например, RBD). Используя подход слияния генов, мы ранее разработали однокомпонентные SApNPs, отображающие стабилизированные тримеры Env ВИЧ-1 ( 58 , 59 ) и оптимизированные ядра E2 HCV ( 57 ).Недавно мы модернизировали E2p и I3-01v9 60-mers, чтобы включить внутренний слой LDs для стабилизации нековалентно сформированной оболочки NP в дополнение к кластеру эпитопов Т-клеток ( 60 ). Эта многослойная конструкция может иметь важное значение для стабильности получаемых вакцин SApNP, когда они используются для отображения больших сложных вирусных антигенов, таких как спайк SARS-CoV-2.

Нативные вирионы SARS-CoV-2 имеют спайки как до, так и после слияния ( 52 , 54 , 55 ) (рис.3A, вверху), в то время как наша стратегия вакцины направлена ​​на разработку однокомпонентных SApNP, каждый из которых представляет 8 или 20 стабильных префузионных пиков S2GΔHR2 в иммунной системе (фиг. 3A, внизу). Как продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях ( 58 , 59 ), для соединения тримеров с поверхностью SApNP могут потребоваться линкеры разной длины, поскольку расстояние между N-концами субъединиц NP вокруг каждой оси третьего порядка варьируется: FR (20 Å), E2p (9 Å) и I3-01v9 (50,5 Å). На основе этого рассмотрения мы отобразили спайк S2GΔHR2 на FR с 5-аминокислотным линкером G ₄ S, на E2p с 5-аминокислотным линкером G ₄ S и на I3-01v9 с 10 –Аминокислота (G ₄ S) ₂ линкер, приводящий к SApNP с диаметром 47.9, 55,9 и 59,3 нм соответственно (рис. 3Б). Многослойные E2p-L4P и I3-01v9-L7P ( 60 ), которые были утверждены для представления RBD (рис. 1, K – L и рис. S1D), использовались здесь как носители NP шипа S2GΔHR2. Вместе три конструкции S2GΔHR2 SApNP временно экспрессировали в 400-мл клетках ExpiCHO с последующей очисткой CR3022 и SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 3C). Три производственных цикла для каждой из трех конструкций сгенерировали очень согласованные профили SEC, несмотря на изменение низкомолекулярных примесей, наблюдаемых для FR и E2p-L4P.После очистки CR3022 и SEC мы получили от 0,3 до 0,4, от 0,5 до 1,0 и от 0,8 до 1,2 мг белка для S2GΔHR2-5GS-FR, S2GΔHR2-5GS-E2p-L4P и S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-L7P, соответственно. . В целом, полученный из I3-01v9 SApNP S2GΔHR2 оказался наиболее эффективным с точки зрения выхода частиц, чистоты и стабильности. Структурная целостность была проанализирована с помощью nsEM, который показал хорошо сформированные частицы размером от 45 до 65 нм с узнаваемыми выступами на поверхности (рис. 3D). Различная форма этих профилей может соответствовать шипам S2GΔHR2 с «открытыми» RBD, в отличие от множества «закрытых» тримеров HIV-1 и EBOV на поверхности SApNP ( 58 — 60 ).Эта открытая конформация может способствовать индукции сильного RBD-специфического ответа NAb in vivo. Антигенность SApNP S2GΔHR2 оценивали с использованием той же панели mAb. В ELISA три SApNP показали немного улучшенное связывание с некоторыми, но не со всеми mAb по сравнению с индивидуальным спайком (фиг. 3E). В BLI мы наблюдали четкую корреляцию между пиковым сигналом связывания mAb и валентностью антигена с E2p / I3-01v9> FR> spike (фиг. 3F). Многовалентный дисплей на двух 60-мерах существенно увеличивал связывание mAb по сравнению с FR 24-мером.В предыдущих исследованиях мы наблюдали аналогичную корреляцию для тримера Env ВИЧ-1 и ядра E2 HCV по сравнению с их SApNP ( 57 , 58 ). Таким образом, эти SApNP размером с VLP с 8 или 20 шипами на поверхности представляют собой многообещающие вакцины-кандидаты для оценки in vivo.

( A ) Схематическое изображение вириона SARS-CoV-2 (вверху) и вакцины SApNP, представляющей спайк (внизу). Для вириона SARS-CoV-2 показаны вирусный геном до / после слияния, нуклеокапсид и РНК, а для вакцины — стабилизированный спайк и многослойная композиция SApNP.( B ) Цветные поверхностные модели носителей SApNP (вверху) и вакцин SApNP, представляющих спайк (внизу). Используемые здесь три носителя SApNP — это 24-мерные FR и многослойные E2p и 60-мерные I3-01v9 (слой LD и кластер PADRE не показаны). Размер частиц указывается диаметром (в нанометрах). ( C ) Профили SEC трех SApNP, представляющих спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2, слева направо, S2GΔHR2-5GS-FR, S2GΔHR2-5GS-E2p-LD4-PADRE (или E2p-L4P) и S2GΔHR2- 10GS-I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P).Профили SEC были получены из колонки Superose 6 10/300 GL, каждая из которых показывает результаты трех отдельных производственных циклов. ( D ) ЭМ-изображения трех SApNP SARS-CoV-2 S2GΔHR2. ( E ) Связывание с помощью ELISA трех SApNP SARS-CoV-2 S2GΔHR2 с пятью mAb. Значения EC ₅₀ (мкг / мл) помечены. ( F ) Антигенные профили спайка SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и трех SApNP против пяти mAb. Сенсограммы были получены с Octet RED96 с использованием шести концентраций антигена (от 150 до 4.6 нМ для шипа, от 9 до 0,27 нМ для FR SApNP и от 3,5 до 0,1 нМ для E2p и I3-01v9 SApNP, соответственно, все путем двукратных разведений) и биосенсоров AHQ, как показано на рис. S3B. Перечислены пиковые сигналы связывания (в нанометрах) при наивысшей концентрации. Цветовая кодировка указывает уровень сигнала, измеренный октетом (от зеленого к красному: от низкого к высокому).

SARS-CoV-1/2 вакцина-индуцированный ответ связывающих антител

Выбранные конструкции вакцины SARS-CoV-1/2 RBD и спайков оценивались на мышах BALB / c (рис.4А). Мы приняли аналогичный протокол иммунизации, чтобы он соответствовал нашим предыдущим исследованиям SApNPs ВИЧ-1, HCV и EBOV ( 57 , 58 , 60 ). Вкратце, группы из пяти мышей иммунизировали четыре раза с 3-недельными интервалами. Все антигены (50 мкг на дозу) были приготовлены с AddaVax, адъювантом эмульсии масло-в-воде, за исключением I3-01v9, который был смешан с фосфатом алюминия ( 83 ). Сначала мы проанализировали ответы связывающих антител (bAb), измеренные титрами EC ₅₀ , в двух группах вакцины SARS-CoV-2 RBD (рис.4B и рис. S4). Связанный со SPY RBD SApNP (RBD-5GS-SPY-5GS-FR) вызывал значительно более высокие титры bAb, чем тример RBD с каркасом (RBD-5GS-1TD0) на 2-й неделе (w2) и w5, независимо от покрывающего антигена, и дало значительное значение P на w8 при нанесении покрытия на RBD. По сравнению со спайком S2P _ECTO (S2P _ECTO -5GS-1TD0) RBD SApNP вызывал значительно более высокие титры bAb против RBD на w2, w5 и w8 (рис. 4B, справа), демонстрируя сильный эпитопный эффект. эффект фокусировки.Сыворотка мышей связала спайк SARS-CoV-1 с более низкими титрами EC ₅₀ , чем спайк SARS-CoV-2, но с аналогичными паттернами (рис. S4A). Затем мы проанализировали ответы bAb, вызванные спайками SARS-CoV-2 S2P _ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0, а также трех SApNPs, каждый из которых имеет 8 или 20 спайков S2GΔHR2 (рис. 4C и рис. S5). . Спайк S2GΔHR2 показал в два-три раза более высокие средние титры EC ₅₀ , чем спайк S2P _ECTO , независимо от покрывающего антигена (примечательно, что для облегчения справедливого сравнения сыворотки мышей из этих двух групп были протестированы против их соответствующего спайка. антигены).Три SApNP демонстрировали разные временные структуры в зависимости от покрывающего антигена. Что касается спайк-специфического ответа, группа I3-01v9 зарегистрировала устойчивое увеличение среднего титра EC ₅₀ с течением времени, показывая самые высокие титры bAb на w2 и w8 и значительно превосходя группу S2P _ECTO во все моменты времени. Группа I3-01v9 также показала более высокие титры EC ₅₀ , чем группа S2GΔHR2, хотя и не со значительными значениями P . Группа FR SApNP показала аналогичную временную картину с более низкими титрами EC ₅₀ , которые все еще были значительно выше, чем группа S2P _ECTO .Среди трех SApNP, E2p показал самый низкий средний титр EC ₅₀ при w2 и достиг наивысшего значения при w5, который затем немного снизился на w8. Что касается ответа, специфичного для RBD, пять групп продемонстрировали четкий рейтинг, основанный на их средних титрах EC ₅₀ , которые оставались неизменными по временным точкам. На w2 I3-01v9 показал средний титр EC ₅₀ , равный 175, тогда как все другие вакцины на основе спайков вызвали слабый RBD-специфический ответ bAb. На w5 и w8, S2GΔHR2 вызывал более высокие титры bAb (в среднем в два раза), чем S2P _ECTO , в то время как все три SApNP превосходили индивидуальный спайк S2GΔHR2 с рейтингом средних титров EC ₅₀ , который коррелировал с их размером (FR < E2p ECTO (S2P _ECTO -5GS-1TD0), скаффолдным тримером RBD (RBD-5GS-1TD0) и SPY-связанным RBD SApNP. (RBD-5GS-SPY-5GS-FR) (Рис. 4D и Рис. S6). На основании средних титров EC ₅₀ , пик SARS-CoV-1 S2P _ECTO , по-видимому, вызывал более устойчивый ответ bAb, чем пик SARS-CoV-2 S2GΔHR2, тогда как SARS-CoV-1 RBD SApNP был менее выгоден, чем его аналог SARS-CoV-2.Реактивность сыворотки с пиком SARS-CoV-2 S2P _ECTO наблюдалась для всех трех групп вакцины против SARS-CoV-1 (рис. S6A). Таким образом, RBD SApNP могут вызывать более высокие титры RBD-специфических bAb, чем скаффолдный тример RBD и спайк S2P _ECTO , хотя и на разных уровнях для двух SARS-CoV. Спайк S2GΔHR2 более иммуногенен, чем спайк S2P _ECTO , показывая, в среднем, в два раза более высокие титры bAb. S2GΔHR2-презентирующие E2p и I3-01v9 SApNP являются лучшими показателями среди всех спайковых вакцин, что согласуется с нашими предыдущими результатами для этих двух крупных SApNP ( 57 , 58 , 60 ).

( A ) Схематическое изображение протокола иммунизации мышей. ( B ) Ответы bAb, индуцированные вакциной SARS-CoV-2 RBD и RBD-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-фолдон (слева) и RBD (справа). ( C ) Спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и ответы bAb, индуцированные вакциной S2GΔHR2-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-фолдон (вверху) и RBD (внизу). В (B) и (C) для сравнения включена группа SARS-CoV-2 S2P _ECTO -5GS-1TD0 с S2P _ECTO -5GS-фолдоном, используемым в качестве покрывающего антигена.( D ) Ответы bAb, индуцированные вакциной SARS-CoV-1 RBD и RBD-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-1 S2P _ECTO -5GS-фолдон (слева) и RBD (справа). В (D) для сравнения включена группа SARS-CoV-1 S2P _ECTO -5GS-1TD0, при этом S2P _ECTO -5GS-фолдон используется в качестве покрывающего антигена. В (B) — (D) нанесены титры EC ₅₀ , полученные из ELISA связывания плазмы мыши с покрывающими антигенами, со средними значениями EC ₅₀ , отмеченными на графиках.Значения P были определены с помощью непарного теста t в GraphPad Prism 8.4.3, где (*) указывает уровень статистической значимости. Подробные данные ELISA показаны на фиг. От S4 до S6.

Вакцина SARS-CoV-1/2 ответ на NAb

Одной из основных целей разработки вакцины COVID-19 является создание мощного NAb-ответа, который может защитить от инфекции SARS-CoV-2. Анализы нейтрализации псевдочастиц (SARS-CoV-1/2-pp) ( 84 ) использовали для оценки сывороточных ответов NAb, вызванных различными вакцинами.Сначала мы проанализировали ответы NAb, измеренные по титрам 50% -ного ингибирующего разведения (ID ₅₀ ), в двух группах вакцины против SARS-CoV-2 RBD (фиг. 5A и фиг. S7). Связанный со SPY RBD SApNP вызывал ответ NAb против аутологичного SARS-CoV-2 еще на w2, хотя и с низкими титрами, и сохранял свое преимущество на w5 и w8, что позволяет предположить, что эти вакцины RBD SApNP могут вызывать быстрый ответ NAb. Группа тримеров RBD с каркасом показала более высокие средние титры ID ₅₀ , чем группа спайков S2P _ECTO как на w5, так и на w8.Несколько иную картину наблюдали в анализе SARS-CoV-1-pp. На w2 ни одна вакцинированная группа не показала детектируемого гетерологичного ответа на NAb. На w5 и w8 спайк S2P _ECTO вызывал более мощный ответ NAb против SARS-CoV-1, чем тример RBD с каркасом, что позволяет предположить, что эпитопы не-RBD на спайке могут вносить вклад в перекрестную нейтрализацию. Затем мы проанализировали ответы NAb, вызванные пятью вакцинами на основе спайков (фиг. 5B и фиг. S8). Что касается аутологичной нейтрализации, ни одна вакцина на основе спайков не вызвала какой-либо ответ NAb, который блокирует SARS-CoV-2-pps после одной дозы, но постоянный образец нейтрализации сыворотки наблюдался на w5 и w8 (рис.5Б, верхняя панель). В частности, спайк S2P _ECTO показал самый низкий средний титр ID _50, , 879 и 2481 на w5 и w8, соответственно, тогда как спайк S2GΔHR2 вызывал более сильный ответ NAb со средним значением ID ₅₀ в 2,8-6,7 раз. титры, которые не достигли P ≤ 0,05 из-за внутригрупповых вариаций. Тем не менее, этот результат подтвердил положительный эффект мутации 2G и делеции стебля HR2 на выявление NAb. Среди трех SApNP, E2p показал наилучшие результаты на w5, показав средний титр ID ₅₀ , равный 8435, то есть 9.В 6 раз выше, чем S2P _ECTO и в 1,4 раза выше, чем S2GΔHR2, в то время как I3-01v9 показал наиболее сильный ответ NAb на w8 со средним титром ID ₅₀ 17 351, что примерно в 7 и 2,5 раза выше чем S2P _ECTO и S2GΔHR2 соответственно. Аналогичная временная картина наблюдалась в анализе гетерологичного SARS-CoV-1-pp (рис. 5B, нижняя панель). Стоит отметить, что многослойный SApNP I3-01v9 вызывал ответ NAb SARS-CoV-1 со средним титром ID ₅₀ 351 на w2, тогда как во всех других группах не было обнаружено нейтрализации сыворотки.Эти результаты предполагают, что хорошо разработанная вакцина SARS-CoV-2 S2GΔHR2 SApNP может обеспечить защиту от обоих SARS-CoV. Наконец, мы проанализировали ответы NAb, вызванные тремя вакцинами против SARS-CoV-1 (рис. 5C и рис. S9). В аутологичном анализе SARS-CoV-1-pp спайк S2P _ECTO и RBD SApNP индуцировали значительно более высокие титры NAb, чем тример RBD на w2 и w5, и все три группы вакцины показали одинаковые титры ID ₅₀ на w2 и w5. w8. Однако нейтрализация гетерологичного SARS-CoV-2 была ниже или на базовом уровне для трех вакцин против SARS-CoV-1 на w2, w5 и w8.В этом исследовании анализ нейтрализации псевдовирусов был подтвержден с использованием панели известных NAb SARS-CoV-1/2 (рис. S9C). В качестве отрицательного контроля сыворотки мышей w8 тестировали против псевдочастиц, несущих Env вируса лейкемии мышей (MLV), MLV-pps, не обнаруживая обнаруживаемой реактивности (фиг. S9D). Таким образом, эти результаты демонстрируют преимущество в выявлении NAb спайком SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и его SApNP по сравнению с широко используемым спайком S2P _ECTO . Хотя SARS-CoV-2 RBD– и S2GΔHR2-представляющие SApNP оба эффективны для индукции аутологичного ответа на NAb, последний может индуцировать высокие титры NAb для SARS-CoV-1 и может обеспечить более широкую защиту от SARS-ассоциированных CoV.

( A ) SARS-CoV-2 RBD и RBD-SApNP вакцинные ответы NAb на аутологичный SARS-CoV-2 (слева) и гетерологичный SARS-CoV-1 (справа). ( B ) Спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и индуцированные вакциной S2GΔHR2-SApNP ответы NAb на SARS-CoV-2 (вверху) и SARS-CoV-1 (внизу). В (A) и (B) для сравнения включена группа SARS-CoV-2 S2P _ECTO -5GS-1TD0. ( C ) SARS-CoV-1 RBD и RBD-SApNP вакцинные ответы NAb на аутологичный SARS-CoV-1 (слева) и гетерологичный SARS-CoV-2 (справа).В (C) для сравнения включена группа SARS-CoV-1 S2P _ECTO -5GS-1TD0. В (A) — (C) нанесены титры ID ₅₀ , полученные из анализов нейтрализации SARS-CoV-1/2-pp, со средними значениями ID ₅₀ , отмеченными на графиках. Значения P были определены с помощью непарного теста t в GraphPad Prism 8.4.3, где (*) указывает уровень статистической значимости. Подробные данные по нейтрализации SARS-CoV-1/2-pp показаны на рис. S7 — S9.

Т-клеточный ответ SARS-CoV-2, индуцированный вакциной

В то время как гуморальный иммунитет необходим для блокирования взаимодействия вируса-хозяина и предотвращения вирусной инфекции, клеточный иммунитет необходим для устранения инфицированных клеток-хозяев с целью контроля вирусной инфекции 88 ).Новые данные указывают на то, что ранний Т-клеточный ответ ( 89 , 90 ), а также Т-клеточная память ( 91 ) имеют решающее значение для защиты от SARS-CoV-2. Однако вакцины против COVID-19 должны индуцировать Т-клеточный ответ CD4 ⁺ T _H 1, но не T _H 2-типа, поскольку последний был вовлечен в ассоциированное с вакциной усиление респираторных заболеваний ( 10 ). Кроме того, T-фолликулярные хелперы (T _fh ) играют важную роль в созревании и производстве NAb.Следовательно, понимание ответов Т-клеток имеет решающее значение для разработки эффективной и безопасной вакцины против COVID-19.

Интерферон-γ (IFN-γ) — продуцирующие клетки T _H 1 важны для выработки оптимального ответа антител и индукции клеточного иммунитета ( 85 — 87 ). Сначала мы исследовали различные вакцины против SARS-CoV-2 на индукцию ответов CD4 ⁺ T _H 1, специфичных к вакцинному антигену, на 11-й неделе, через 2 недели после четвертой иммунизации, когда Т-клетки памяти уже развились в селезенке ( 88 ).Спленоциты мышей из группы S2P _ECTO и двух групп S2GΔHR2 SApNP (E2p и I3-01v9) анализировали проточной цитометрией с использованием наивных образцов в качестве отрицательного контроля. Группа I3-01v9 индуцировала примерно в 1,5 и 2,3 раза более высокую частоту продуцирующих IFN-γ клеток CD4 ⁺ T _H 1, чем группы S2P _ECTO и E2p, соответственно (рис. 6A). Примечательно, что после рестимуляции соответствующими антигенами в течение всего 4 часов обе группы SApNP продуцировали примерно в 2 раза более высокую частоту CD107a-продуцирующих цитолитических CD4 ⁺ Т-клеток, чем S2P _ECTO и наивные группы (рис.6Б). Двойные положительные клетки IFN-γ / интерлейкина-4 (IL-4) представляют собой CD4 ⁺ Т-клетки памяти, которые приобрели способность продуцировать IL-4, сохраняя при этом способность продуцировать IFN-γ при T _H 1 условия ( 92 ). Оказалось, что I3-01v9 индуцировал в три и пять раз больше IFN-γ / IL-4 двойных положительных Т-клеток памяти CD4 ⁺ , чем S2P _ECTO и E2p (фиг. 6A). Эти результаты предполагают, что I3-01v9 может индуцировать как CD4 ⁺ T _H 1 клетки, так и IFN-γ / IL-4, дважды положительные CD4 ⁺ Т-клетки памяти.Кроме того, I3-01v9 индуцировал больше двойных положительных CD8 ⁺ эффекторных Т-клеток IFN-γ / гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), чем S2P _ECTO и E2p (фиг. 6C), что позволяет предположить, что защитный CD8 ⁺ Т-клетки также генерировались у мышей, иммунизированных I3-01v9. Примечательно, что Т-клетки CD8 ⁺ , полученные от мышей, иммунизированных I3-01v9, а не от мышей с S2P _ECTO и E2p, приобрели способность быстро продуцировать IFN-γ после рестимуляции антигена (рис.6D), что свидетельствует о генерации I3-01v9-чувствительных эффекторных Т-клеток / Т-клеток памяти. Наши результаты показывают, что SApNP S2GΔHR2 I3-01v9 может индуцировать устойчивые Т-клеточные ответы, состоящие из CD4 ⁺ T _H 1 клеток, IFN-γ / IL-4 с двойной положительной памятью CD4 ⁺ Т-клеток и эффекторных CD8. ⁺ Т-клеток, обеспечивая таким образом защитный клеточный иммунитет в дополнение к мощному ответу на NAb. Поскольку нельзя исключить Т-клеточный иммунитет против основы SApNP, может потребоваться более подробный анализ Т-клеток с использованием растворимых спайков, спайковых пептидов и голых SApNP для рестимуляции.

спленоцитов мышей ( n = 5 в каждой группе), иммунизированных спайком S2P _ECTO , S2GΔHR2 E2p SApNP и S2GΔHR2 I3-01v9 SApNP, были выделены на w11 и культивированы в присутствии IL-2 и дендритных клеток. (DC) в импульсном режиме с S2P _ECTO (1 × 10 ⁻⁷ мкМ), S2GΔHR2 E2p (1 × 10 ⁻⁷ мкМ) и S2GΔHR2 I3-01v9 (1 × 10 ⁻⁷ мкМ), соответственно .Спленоциты от пяти наивных мышей использовали в качестве контрольных образцов и культивировали в присутствии DC без пульсации антигена. Клетки оценивали через 16 часов ( A и C ) и 4 часа ( B и D ) культивирования. (A и B) Индуцированный вакциной CD4 ⁺ Т-клеточный иммунитет. (C и D) Индуцированный вакциной CD8 ⁺ Т-клеточный иммунитет. Графики показывают частоты фракции клеток. Значения P определяли односторонним анализом ANOVA. * P <0.05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

ОБСУЖДЕНИЕ

COVID-19 — первая всемирная пандемия такого масштаба после печально известного испанского гриппа более века назад ( 93 ), который вызвал около 50 миллионов смертей во всем мире и остается болезненным напоминанием о нашей уязвимости перед новым вирусом. без защитной вакцины. Поэтому быстрое распространение SARS-CoV-2 потребовало быстрой разработки вакцины ( 10 ). Операция Warp Speed ​​(OWS) была запущена в мае 2020 года с первоначальной целью доставить 300 миллионов доз безопасных и эффективных вакцин к январю 2021 года ( 94 ), хотя эта цель еще не реализована.Тем не менее, в декабре 2020 года, когда другие вакцины-кандидаты все еще проходили клинические испытания, две мРНК-вакцины, поддерживаемые OWS, были одобрены для EUA, что стало важным поворотным моментом в борьбе с пандемией. Однако разработка вакцины во время пандемии против нового вируса ставит уникальные задачи, одна из которых заключается в том, как сбалансировать потребности общественного здравоохранения с научной строгостью ( 95 — 97 ). Глобальная кампания по вакцинам также предоставляет уникальную возможность сравнить различные стратегии и платформы разработки вакцин, особенно новые, с общей целью.В то время как мРНК и вирусные векторные вакцины остаются лидерами, в недавнем обзоре белковые вакцины освещены с прогнозом, что они в конечном итоге достигнут большей части населения мира ( 98 ). Поскольку титры NAb, вызванные вакцинами на основе нуклеиновых кислот первого поколения, со временем ослабевают, потребуются эффективные белковые вакцины для поддержания долгосрочного иммунитета против SARS-CoV-2.

Здесь мы подошли к вакцине против SARS-CoV-2 с рациональной стратегией дизайна и намеревались разработать вакцины с протеиновыми NP, которые можно использовать отдельно или в качестве бустерной вакцины.С этой целью была создана панель кандидатов в вакцины на основе трех платформ SApNP с различными атрибутами in vitro и in vivo (таблица S1). Наш сравнительный анализ этих вакцинных конструкций дал некоторые ценные сведения. Во-первых, выбор антигена имеет решающее значение для успеха вакцины против SARS-CoV-2 независимо от платформы доставки. Большинство вакцинных антигенов, включая кандидаты в вакцины OWS, основаны на S2P, который дает структуру шипа, которая в деталях отличается от полноразмерного шипа дикого типа, т.е.g., в FPPR S2 и в относительном расположении доменов S1 ( 52 ). Эти различия могут затруднить интерпретацию результатов вакцинации. S2P и другие эмпирические конструкции шипов ( 53 ) пытались ограничить конформацию шипа и увеличить выход тримеров. Однако, как мы ранее продемонстрировали для ВИЧ-1 Env и EBOV GP ( 58 , 60 , 81 ), важно определить и устранить (если возможно) причину метастабильности спайка.Во время антигенного скрининга мы обнаружили, что делеция ножки HR2 с заменой 2P-на-2G обеспечивает более стабильный спайк, что согласуется с недавними сообщениями об очень гибкой ножке HR2 в нативных спайках на вирионах SARS-CoV-2 ( 54 — 56 ). Таким образом, S2GΔHR2, по-видимому, представляет собой серьезный прорыв в конструкции шипов. Во-вторых, однокомпонентные SApNP обеспечивают мощную платформу для разработки вакцины против различных вирусных патогенов ( 57 , 58 , 60 ).Здесь S2GΔHR2 был генетически слит, а не химически связан с тремя SApNP, включая два многослойных 60-мерных носителя с повышенной стабильностью и встроенным Т-справочным сигналом. Эти белковые вакцины должны быть более эффективными в индукции сильного ответа NAb и с меньшей вероятностью вызывать нежелательные реакции ( 98 , 99 ). Стратегия вакцины, ориентированная на эпитопы, также была исследована путем создания каркасных тримеров RBD и SPY-связанных SApNP RBD. В-третьих, для достижения высокой эффективности и обеспечения безопасности перед клиническими испытаниями необходимо оценить индуцированные вакциной NAb и Т-клеточные ответы на животных.В нашем исследовании на мышах S2GΔHR2 оказался более эффективным, чем S2P в выявлении NAb, как отдельно, так и отображаемых на SApNP. Примечательно, что многослойный SApNP S2GΔHR2 I3-01v9 вызывал не только высокие титры NAb, но также желаемые Т-клеточные ответы. Помимо CD4 ⁺ T _H 1 и CD4 ⁺ Т-клеток памяти, этот SApNP также индуцировал CD107a-продуцирующие цитолитические CD4 ⁺ Т-клетки, которые могут напрямую убивать инфицированные клетки-хозяева, и GM-CSF– продуцируют эффекторные Т-клетки CD8 ⁺ , которые могут способствовать образованию макрофагов и функциональных дендритных клеток (ДК), способствующих удалению инфицированных клеток.Также стоит отметить, что ответ NAb на большие SApNPs стабилизировался после трех доз, предполагая, что количество инъекций и дозировка могут быть уменьшены без уменьшения ответов, индуцированных вакциной. Наконец, экспрессия вакцинных антигенов в клетках СНО с последующей очисткой с использованием колонки с антителами, такой как CR3022, позволит быстрое производство вакцины в промышленных масштабах. Таким образом, наше исследование предоставляет многообещающие вакцины-кандидаты от COVID-19 для оценки в ходе клинических испытаний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн, экспрессия и очистка SARS-CoV-1/2 RBD и антигенов шипа

Гены шипа (S) изолята SARS-CoV-1 Tor2 (номер доступа в GenBank: NC_004718) и Изолят SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (номер доступа в GenBank: MN^{7) использовали для создания всех конструкций RBD и spike после оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих.Последовательность RBD определяется как P317-D518 и P330-N532 для SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно. Последовательность SEC _TO определяется как M1-Q1190 и M1-Q1208 для SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно. Чтобы удалить сайт расщепления S1 / S2, в шипы SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 были введены мутация R667G и модификация 682 GSAGSV 687 соответственно. Мутация 2P (или 2G) была сделана для K968 / V969 и K986 / V987 в шипах SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно.С-концевую область SARS-CoV-2 (E1150-Q1208), содержащую ножку HR2, удалили из S2G _ECTO , в результате чего была получена спайковая конструкция с делецией HR2, названная S2GΔHR2. Вирусный капсидный белок SHP (PDB: 1TD0) был использован в качестве мотива тримеризации в спайковых конструкциях для иммунизации, тогда как фолдоновый домен из фибритина бактериофага Т4 (PDB: 1RFO) использовался для покрытия спайковых антигенов для ELISA, чтобы замаскировать 1TD0- производный ответ антител. Все конструкции временно экспрессировались в клетках ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific).Вкратце, клетки ExpiCHO размораживали и инкубировали со средой для экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific) в шейкере-инкубаторе при 37 ° C, 135 об / мин и 8% CO ₂ . Когда клетки достигли плотности 10 × 10 6 мл -1 , добавляли экспрессионную среду ExpiCHO для уменьшения плотности клеток до 6 × 10 6 мл -1 для трансфекции. Комплексы ExpiFectamine CHO / плазмидная ДНК получали для трансфекции 100 мл в клетки ExpiCHO в соответствии с инструкциями производителя.Для данной конструкции 100 мкг плазмиды и 320 мкл реагента ExpiFectamine CHO смешивали в 7,7 мл холодной среды OptiPRO (Thermo Fisher Scientific). После первого кормления в день 1 клетки ExpiCHO культивировали в шейкере-инкубаторе при 33 ° C, 115 об / мин и 8% CO ₂ , следуя протоколу Max Titer с дополнительным кормом на 5 день (Thermo Fisher Scientific). Супернатанты культур собирали через 13-14 дней после трансфекции, осветляли центрифугированием при 4000 об / мин в течение 25 минут и фильтровали с использованием фильтра 0.Фильтр 45 мкм (Thermo Fisher Scientific). Колонку с антителами CR3022 использовали для экстракции антигенов SARS-CoV-1/2 из супернатантов, после чего проводили SEC на колонке Superdex 200 10/300 GL (для каркасных тримеров RBD) или колонке Superose 6 10/300 GL ( для SPY-связанных SApNP RBD, шипов и SApNP S2GΔHR2). Человеческий NAb, P2B-2F6 ( 36 ), также использовали для упаковки колонок с антителами для очистки пика SARS-CoV-2 S2GΔHR2, за которым следовали SEC на колонке HiLoad 16/600 Superose 6.Для сравнения, спайковый белок SEC _TO -5GS-1TD0 с меткой His ₆ экстрагировали из супернатантов с использованием колонки Excel с иммобилизованной Ni-сефарозой (GE Healthcare) и элюировали 500 мМ имидазолом перед SEC. Концентрацию белка определяли с использованием поглощения УФ ₂₈₀ с теоретическими коэффициентами экстинкции.}

Нативный PAGE

Шипы SARS-CoV-2 и SApNP, представляющие шипы, анализировали с помощью синего нативного PAGE и окрашивали кумасси синим.Белки смешивали с буфером для образцов и загрузочным красителем G250 и добавляли к 4-12% гелю Bis-Tris NativePAGE (Life Technologies). Гели BN-PAGE запускали в течение от 2 до 2,5 часов при 150 В с использованием рабочего буфера NativePAGE (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуноферментный анализ

Каждую лунку 96-луночного аналитического планшета Costar (Corning) сначала покрывали 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,2 мкг соответствующих антигенов.Планшеты инкубировали в течение ночи при 4 ° C, а затем пять раз промывали промывочным буфером, содержащим PBS и 0,05% (об. / Об.) Tween 20. Затем каждую лунку покрывали 150 мкл блокирующего буфера, состоящего из PBS и блокатора для блоттинга. (40 мг мл ^-1 ) (Bio-Rad). Планшеты инкубировали с блокирующим буфером в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем пять раз промывали промывочным буфером. Для связывания антигена антитела [в форме иммуноглобулина G (IgG)] разводили в блокирующем буфере до максимальной концентрации 5 мкг / мл ^-1 с последующей серией 10-кратных разведений.Для каждого разведения антител в соответствующие лунки добавляли в общей сложности 50 мкл. Для анализа образцов мышей плазму разбавляли в 20-кратном блокирующем буфере и подвергали серии 10-кратных разведений. Для каждого разведения образца в лунки добавляли в общей сложности 50 мкл объема. Каждый планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем пять раз промывали PBS, содержащим 0,05% твин 20. Для связывания антител использовали разведение 1: 5000 козьих антител против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), или, для анализа образцов мышей, разбавление 1: 3000 меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories) затем готовили в промывочном буфере (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) с 50 мкл этого разбавленного вторичного антитела добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали со вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем шесть раз промывали PBS, содержащим 0,05% Твина 20. Наконец, лунки проявляли 50 мкл триметилбора (Life Sciences) в течение 3-5 минут перед остановкой реакция с 50 мкл 2 н. серной кислоты.Полученные показания планшета были измерены при длине волны 450 нм. Примечательно, что связывание w2 с сывороткой не достигло плато (или насыщения), чтобы обеспечить точное определение титров EC ₅₀ . Тем не менее, значения EC ₅₀ для w2 были получены путем установки нижних / верхних ограничений OD ₄₅₀ (оптическая плотность при 450 нм) на 0,0 / 3,2, чтобы облегчить сравнение различных групп вакцин в первый момент времени.

Биослойная интерферометрия

Кинетика вакцинных антигенов SARS-CoV-1/2, RBD по сравнению с RBD-представляющими SApNP, а также спайк-по сравнению с представляющими спайк SApNP, связывалась с панелью известных антител (в форме IgG) измерено с помощью прибора Octet RED96 (FortéBio, Pall Life Sciences).Все анализы выполняли при перемешивании со скоростью 1000 об / мин в 1 × кинетическом буфере FortéBio. Конечный объем всех растворов составлял 200 мкл на лунку. Анализы проводили при 30 ° C в твердых 96-луночных планшетах черного цвета (Geiger Bio-One). Для всех антигенов, за исключением SApNP S2GΔHR2, антитело (5 мкг мл ^-1 ) в 1 × кинетическом буфере загружали на поверхность биосенсоров захвата Fc человека (AHC) на 300 с. Для SApNP S2GΔHR2 использовали биосенсоры количественного определения Fc человека (AHQ). Шаг 60-секундного базового уровня биосенсора применяли перед анализом ассоциации антитела на биосенсоре с антигеном в растворе в течение 200 секунд.Двукратный градиент концентрации антигена, начиная с 950 нМ для каркасных тримеров RBD, 37 нМ для SPY-связанных RBD FR SApNP (RBD-5GS-SPY-5GS-FR), 150 нМ для растворимых шипов и 9 / 3,5 / 3,5 нМ для S2GΔHR2, представленного на SApNP FR / E2p / I3-01v9, использовали в серии из шести титрований. Диссоциация взаимодействия прослеживалась в течение 300 с. Корректировку смещения базовой линии выполняли путем вычитания среднего значения сдвигов, зарегистрированных для сенсора, загруженного антителом, но не инкубированного с антигеном, и для сенсора без антител, но инкубированного с антигеном.Данные октетов обрабатывались программой сбора данных FortéBio v.8.1. Экспериментальные данные были согласованы с уравнениями связывания, описывающими взаимодействие 2: 1 для достижения оптимального соответствия. Следует отметить, что пик S2GΔHR2 также измеряли с использованием биосенсоров AHQ для облегчения сравнения связывания mAb с SApNP, представляющими S2GΔHR2.

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Кривые термического плавления SARS-CoV-2 S2P _ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0 спайковых белков после очистки CR3022 и SEC были получены с помощью прибора MicroCal PEAQ-DSC Man (Malvern) .Очищенный белок тримера спайков, продуцируемый клетками ExpiCHO, заменяли буфером на 1 × PBS и концентрировали до 0,8 мкМ перед анализом с помощью прибора. Плавление исследовали при скорости сканирования 60 ° C час ^-1 от 20 ° до 100 ° C. Обработка данных, включая коррекцию буфера, нормализацию и вычитание базовой линии, проводилась с использованием программного обеспечения MicroCal PEAQ-DSC. Подгонка по Гауссу проводилась с использованием программы Origin 9.0.

ЭМ-оценка конструкций NP

ЭМ-анализ различных SApNP, представляющих RBD и S2GΔHR2, был выполнен центром микроскопии ядра в Исследовательском институте Скриппса.Все образцы SApNP были приготовлены в концентрации от 0,01 до 0,05 мг / мл. Покрытые углеродом медные решетки (400 меш) подвергали тлеющему разряду, и 8 мкл каждого образца адсорбировались в течение 2 мин. Избыточный образец был удален, и сетки были отрицательно окрашены 2% уранилформиатом в течение 2 минут. Лишнее пятно было удалено, а сеткам дали высохнуть. Образцы анализировали при 80 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа Talos L120C (Thermo Fisher Scientific), а изображения получали с помощью камеры CETA 16M CMOS (комплементарный металл-оксидный полупроводник).

Иммунизация животных и сбор образцов

Об аналогичных протоколах иммунизации сообщалось в наших предыдущих исследованиях вакцин ( 57 , 58 , 60 ). Вкратце, руководящие принципы Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) соблюдались с животными, испытанными в исследовании иммунизации. Восьминедельных мышей BALB / c были приобретены в лаборатории Джексона и помещены в вентилируемые клетки в комнатах с контролируемой средой в Исследовательском институте Скриппса в соответствии с утвержденным протоколом IACUC и AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными) Международные руководящие принципы.Мышей иммунизировали на w0, w3, w6 и w9 с помощью 200 мкл смеси антиген / адъювант, содержащей 50 мкг вакцинного антигена и 100 мкл адъюванта, AddaVax или Adju-Phos (InvivoGen), внутрибрюшинным путем. Кровь собирали через 2 недели после каждой иммунизации. Все кровотечения проводились через ретроорбитальный синус с использованием гепаринизированных капиллярных пробирок в пробирки, покрытые ЭДТА. Образцы вращали со скоростью 1200 об / мин в течение 10 минут для разделения плазмы (верхний слой) и остальной части слоя цельной крови. После тепловой инактивации при 56 ° C в течение 30 минут плазму вращали при 2000 об / мин в течение 10 минут для удаления осадков.Оставшуюся часть слоя цельной крови разбавляли равным объемом PBS, а затем накладывали на 4,5 мл фиколла в 15-мл пробирке SepMate (STEMCELL Technologies) и центрифугировали при 1200 об / мин в течение 10 мин при 20 ° C для отделения периферических сосудов. мононуклеарные клетки крови (PBMC). Клетки промывали один раз в PBS, а затем ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса красных кровяных клеток ACK (Lonza). После промывания PBS РВМС ресуспендировали в 2 мл Bambanker Freezing Media (Lymphotec). Селезенки собирали на w11 и измельчали ​​против ситечка для клеток 70 мкм (BD Falcon) для высвобождения спленоцитов в суспензию клеток.Спленоциты центрифугировали, промывали в PBS, обрабатывали 5 мл лизирующего буфера хлорида аммония-калия (ACK) (Lonza) и замораживали с помощью 3 мл среды для замораживания Bambanker. Плазму использовали для ELISA и анализов нейтрализации для определения ответов на связывание и NAb в сыворотке мышей.

Анализ нейтрализации псевдовируса SARS-CoV-1/2

использовали для оценки нейтрализующей активности ранее сообщенных антител и реакции мышиных антител, индуцированной вакциной.SARS-CoV-1/2-pps были получены путем котрансфекции клеток 293T эмбриональной почки человека (HEK) с плазмидой pNL4-3.lucR-E- ВИЧ-1 (полученной из программы реагентов для СПИДа Национального института здравоохранения: www. aidsreagent.org/) и плазмиду экспрессии, кодирующую ген S изолята Tor2 SARS-CoV-1 (номер доступа в GenBank: NC_004718) и изолята SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (номер доступа GenBank: MN^{7) на Соотношение 4: 1 по данным Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). Через 48-72 часа SARS-CoV-1/2-pps собирали из супернатанта центрифугированием при 4000 об / мин в течение 10 минут, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C перед использованием.MAb в начальной концентрации от 0,1 до 10 мкг / мл или плазму мыши в начальном 100-кратном разведении смешивали с супернатантом, содержащим SARS-CoV-1/2-pps, и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. в 96-луночном планшете с твердым дном белого цвета (Corning). В анализе использовали серию трехкратных разведений. Клеточная линия HEK293T-hACE2 (каталожный номер: NR-52511) и вектор pcDNA3.1 (-), содержащий ген SARS-CoV-2 S (каталожный номер: NR52420), были получены из BEI RESOURCES (www.beiresources.org/ ) и использовались в анализах нейтрализации псевдовирусов ( 84 ).Вкратце, клетки HEK293T-hACE2 при 1 × 10 4 добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. После инкубации вышележащие среды удаляли и клетки лизировали. Сигнал люциферазы светлячков от инфицированных клеток определяли с использованием системы анализа люциферазы Bright-Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Данные были получены с микропланшетного ридера BioTek с программным обеспечением Gen 5, средняя фоновая люминесценция из серии неинфицированных лунок была вычтена из каждой лунки, и кривые нейтрализации были построены с использованием GraphPad Prism 8.4.3, в котором значения из лунок сравнивались с лунками, содержащими только SARS-CoV-1/2-pp. Те же векторы ВИЧ-1, псевдотипированные геном Env MLV, названные MLV-pps, были продуцированы в клетках HEK293T и включены в анализы нейтрализации в качестве отрицательного контроля. Поскольку титры NAb выходили на плато после w8, результаты для w11 не были показаны на фиг. 5, но включены в фиг. S7 — S9 для сравнения.}

Продукция DC

Костный мозг мыши культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и рекомбинантный лиганд Flt3 мыши (Flt3L; 50 нг / мл) и фактор стволовых клеток (SCF; 10 нг / мл) в течение 9 дней. описан ( 100 ).Чтобы вызвать активацию DC, незрелые DC инкубировали с липополисахаридом (100 нг / мл) и R848 (резиквимод; 100 нг / мл) в течение ночи, что активировало Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), TLR7 / 8 или TLR9, соответственно. Клетки собирали для экспериментов. ДК были отсортированы для выделения клеток CD11c ⁺ с использованием магнитных шариков (Miltenyi Biotec, CA).

Антитела и анализ проточной цитометрии

Все антитела, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания, были приобретены у eBioscience (Сан-Диего, Калифорния), BioLegend (Сан-Диего, Калифорния) или BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния).Антитела, конъюгированные с магнитными микрошариками, и стрептавидин были приобретены в Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Рекомбинантный человеческий белок IL-2 был приобретен в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Рекомбинантный мышиный Flt3L и мышиный SCF были приобретены в Shenandoah Biotech (Warwick, PA). Клетки окрашивали соответствующими концентрациями mAb. Мертвые клетки были исключены с помощью Fixable Viability Dye от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния). Анализы проточной цитометрии выполняли с использованием цитометров LSRII (BD Biosciences, Калифорния) и Canto (Becton Dickinson, Нью-Джерси).Клетки сортировали на BD FACSAria II (BD Biosciences, Калифорния).

Культура и активация Т-клеток

Мононуклеарные клетки селезенки из каждой группы иммунизированных мышей культивировали в присутствии ДК, пульсирующих с S2P или без него _ECTO , многослойный S2GΔHR2-представляющий E2P или I3-01v9 SApNP (1 × 10 ^-7 мкМ) в полной модифицированной среде Дульбекко Искова (IMDM), содержащей IL-2 (5,0 нг / мл). Клетки собирали через 16 и 4 часа для окрашивания внутриклеточных цитокинов и анализа проточной цитометрии.

Статистика

Для анализа антител сравнения различных групп вакцины были выполнены в GraphPad Prism 8.4.3 с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t . Для анализа Т-клеток сравнение средних значений проводили с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t , дисперсионного анализа (ANOVA), а затем апостериорного теста t . P Значения 0,05 или меньше считались значимыми.

Благодарности: Финансирование: Эта работа финансировалась грантами NIH AI129698 и AI140844 (J.Z.), Ufovax / SFP-2018-0416, Ufovax / SFP-2018-1013 и Ufovax / SFP-2020-0111 (к J.Z.). Вклад авторов: Дизайн проекта: L.H., Y.Z., I.A.W. и J.Z .; конструкция конструкции RBD и иммуногенов на основе шипов L.H. и J.Z .; плазмидный дизайн и обработка L.H. and C.S .; производство, очистка и базовая характеристика антигена L.H., X.L. и T.N .; производство антител и упаковка колонок L.H., X.L. и T.N .; ELISA антитело-антиген и BLI от L.H. and C.S .; DSC Л.Х. и Дж.Z .; негативное окрашивание EM от L.H. and J.Z .; ELISA плазма-антиген от L.H., X.L. и C.S .; нейтрализация антител и плазмы мыши с помощью L.H. и X.L .; анализ индуцированного вакциной Т-клеточного ответа, проведенный Y.W., C.A. и Y.Z .; рукопись, написанная L.H., Y.Z., I.A.W. и J.Z. Всех авторов попросили прокомментировать рукопись. Номер рукописи TSRI: 30028. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у соответствующего автора.

Новые иммунотерапевтические препараты нацелены на два ускользающих белка, вызывающих рак | Наука

Т-клетки, атакующие опухолевые клетки

Автор: Джоселин Кайзер, мар.1, 2021 г., 11:00

Исследователи показали на мышах, что дизайнерские антитела могут сдерживать рост опухолей, нацеливаясь на двух самых печально известных виновников рака — белки RAS и p53, которые мутируют во многих опухолях, но в значительной степени бросают вызов усилиям по разработке лекарств. Если их обещание подтвердится в клинических испытаниях, такие лекарства могут дать возможность иммунной системе организма бороться с трудноизлечимыми формами рака, включая рак поджелудочной железы и яичников.

«Это захватывающе», — говорит иммунолог Джон Вейданц из Техасского университета в Арлингтоне, который стал соучредителем компании, которая занимается аналогичными видами иммунотерапии, называемыми биспецифическими антителами.Новые препараты могут фиксироваться на нескольких фрагментах p53 или RAS, выступающих с поверхности опухолевой клетки, а затем запускать иммунные клетки для их атаки. «Терапия может сработать, когда на клетках действительно мало мишеней. Это большое дело », — говорит Вейданц, который написал комментарий к газетам.

P53 является супрессором опухолей, а неповрежденный белок помогает здоровым клеткам восстанавливать ДНК — или самоуничтожаться, если повреждение не может быть исправлено. Когда р53 выключен в опухолях, они могут бесконтрольно расти.Но нацелить p53 с помощью лекарств сложно, потому что восстановить его активность намного сложнее, чем подавить его активность или выключить его производство — более типичные лекарственные стратегии против неправильно функционирующих белков.

RAS, который сигнализирует клеткам о неконтролируемом росте при мутации, было трудно нацелить с помощью ингибиторов из-за его гладкой формы и отсутствия очевидных сайтов связывания.

И оба белка функционируют внутри клеток, что затрудняет борьбу с ними с помощью сконструированных антител, версий Y-образных белков, которые наша иммунная система использует, чтобы пометить чужеродных захватчиков для уничтожения.Антитела не могут легко проникнуть внутрь клеток, поэтому лекарства на их основе лучше всего работают против раковых белков, которые выходят из поверхности опухолевой клетки.

Но даже несмотря на то, что RAS и p53 остаются внутри опухолевых клеток, на поверхности клетки есть их следы, фрагменты, которые может уловить иммунная система. Чтобы нацелить эти фрагменты мутантного p53 и RAS, известные как неоантигены, лаборатория генетика рака Берта Фогельштейна из Университета Джона Хопкинса обратилась к биспецифическим антителам. Стандартные антитела имеют два идентичных плеча, но биспецифические созданы так, чтобы иметь одно плечо, которое связывается с иммунными солдатами, называемыми Т-клетками, а другое — с поверхностным белком раковой клетки, соединяя клетки и активируя иммунную клетку для атаки на своего нового, злокачественного партнера. .

Проблема заключалась в том, что кусочки мутантного p53 и RAS, на которые могло нацеливаться антитело, чрезвычайно редки для опухолевых клеток — менее 10 копий на клетку, как выяснили исследователи. На открытие биспецифического антитела, которое могло бы связываться с ними, но не со здоровыми клетками, понадобилось более 5 лет аспирантам Хопкинса Эмили Сюэ и Жаклин Дуглас и их команде. Во-первых, они протестировали библиотеку фрагментов антител, чтобы найти те, которые прилипли к неоантигенам p53 и RAS. Затем они преобразовали эти фрагменты в различные конструкции биспецифических антител и проверили, какие из них лучше всего побуждают Т-клетки убивать раковые клетки в чашке.По словам молекулярного биолога Шибин Чжоу из Хопкинса, который был одним из руководителей работы, эта стратегия была «осознанным методом проб и ошибок».

В конце концов, команда разработала «диатело», нацеленное на р53, компактное двуплечье антитело, лишенное основы типичного Y-образного антитела. У мышей с опухолевыми клетками, несущими специфическую мутацию в гене p53, эта биспецифичность резко сдерживает рост опухоли, сообщают исследователи сегодня в Science . Два отдельных диатела RAS хорошо работали на линиях культивируемых клеток с двумя разными мутациями, способствующими развитию рака, и незначительно замедляли рост опухолей у мышей, пишет сегодня команда в Science Immunology .В третьем исследовании, проведенном научным сотрудником Суманом Полом, тот же тип урезанных антител с двойной мишенью также работал у мышей против типа лейкемии, в которой участвуют Т-клетки, сообщают они в Science Translational Medicine . Его мишенью был еще один трудноизлечимый вид рака.

Исследования идут с оговорками. Для лечения пациентов исследователи должны были бы разработать панель биспецифических антител, адаптированную как к иммунным белкам человека, так и к конкретным генетическим мутациям p53 или RAS в их опухоли.(Биспецифичность лейкемии также должна соответствовать Т-клеточному раку пациента.) Поскольку у них отсутствует Y-ствол нормальных антител, диатела исчезают из кровотока быстрее, поэтому их придется вводить непрерывно в течение нескольких недель с помощью помпы. пациентом. «Есть разные пути по многим причинам», — говорит Фогельштейн, описывая сегодняшнюю работу на онлайн-встрече «Успехи в области геномной биологии и технологии».

Тем не менее, сторонние исследователи полны энтузиазма. Хотя другие группы также работают над биспецифическими антителами, которые нацелены на белки внутриклеточного рака, «это, по-видимому, один из первых агентов, направленных на мутантный P53, критический супрессор опухолей», — говорит ученый-врач Дэвид Шейнберг из Мемориального онкологического центра им. Слоуна Кеттеринга. консультирует биотехнологические компании, работающие в этой сфере.(Хопкинс подал заявки на патенты, связанные с лечением.)

И хотя исследователи добиваются прогресса в разработке других лекарств от рака с РАС, эти препараты не задействуют иммунную систему и, вероятно, перестанут работать в течение 1 года, поскольку опухоли станут устойчивыми, прогнозирует Вайданц. Биспецифические антитела, которые могут спровоцировать широкий иммунный ответ, предлагают «потенциал для более крупномасштабной войны, в которой, будем надеяться, иммунная система сможет победить».

белков, связанных с главным геном аутизма, могут помочь в ранней диагностике | Спектр

rost9 / Adobe Stock

Согласно новому исследованию, уровень в крови белков, связанных с геном PTEN, связанным с аутизмом, может влиять на течение заболевания. По словам исследователей, тесты, измеряющие эти молекулы, также могут помочь клиницистам диагностировать аутизм и другие неврологические состояния и наметить их траектории.

«Возможно, мы сможем сделать полезные клинические прогнозы относительно исходов, которые могут помочь раньше адаптировать вмешательства и помочь пациентам и их семьям спланировать то, что необходимо», — говорит ведущий исследователь Томас Фрейзер, профессор психологии Университета Джона Кэрролла в Юниверсити-Хайтс. Огайо.

Ген PTEN кодирует белок, который подавляет опухоли, а также влияет на связи между нейронами. Мутации в PTEN связаны не только с доброкачественными опухолями и несколькими типами рака, но также с аутизмом и макроцефалией или с необычно большой головой.

Однако многое остается неизвестным о том, почему мутации PTEN могут по-разному влиять на людей с аутизмом и без него. Например, мутации PTEN часто связаны с нарушением психической функции у аутичных людей, но не так часто у людей, не страдающих аутизмом, чьи черты могут широко варьироваться.

В новом исследовании Фрейзер и его коллеги изучили, как мутации влияют на уровень в крови не только белка PTEN, но и белков, с которыми он взаимодействует.

Команда оценила уровни различных белков в крови, а также коэффициент интеллекта (IQ) и другие факторы, связанные с умственной функцией, у 25 аутичных и 16 неаутичных участников с мутациями PTEN и макроцефалией, всем в среднем около 9 лет. Исследователи также обследовали 20 участников, в среднем около 14 лет, с аутизмом, макроцефалией и отсутствием мутаций PTEN.

PTEN отражает оценку умственной функции. Например, хотя участники с мутациями PTEN обычно имели самый низкий уровень белка PTEN, участники с высокими уровнями во всех трех группах, как правило, имели более низкие IQ, рабочую память, языковые способности и другие показатели когнитивных навыков.

«Это меня удивило — я ожидал, что чем ниже уровни PTEN, тем хуже будет IQ», — говорит Худа Зогби, профессор молекулярной генетики и генетики человека в Медицинском колледже Бейлора в Хьюстоне, штат Техас, который не принимал участия в исследовании.

Участники с повышенным уровнем PTEN могут иметь обильные, но ненормальные версии белка, полагают Фрейзер и его коллеги.

«Если у них более высокий уровень белка, но это не функциональный белок, это может быть хуже, чем отсутствие копии гена этого белка», — говорит Зогби.

Более высокие уровни двух связанных с PTEN молекул — протеинкиназы AKT и ингибитора фермента p27 — также отслеживаются с улучшением психической функции. Оба белка могут помочь изменить эффекты мутаций PTEN, что может объяснить, почему мутации PTEN могут по-разному влиять на поведение и когнитивные навыки, говорит Фрейзер.Результаты появились в январе в Molecular Autism .

Кроме того, аутичные дети с мутациями PTEN и макроцефалией имели контрольные уровни в крови двух других белков: пониженный MnSOD, который помогает катализировать реакции в митохондриях, и повышенный P-S6, который помогает регулировать метаболизм. Исследование предполагает, что поиск этой закономерности может облегчить раннюю диагностику.

Одним из ограничений новой работы является то, что она включала относительно небольшое количество участников с мутациями PTEN, предупреждает Фрейзер.Он и его команда планируют со временем привлечь больше участников, чтобы помочь проверить результаты и узнать, какие белки играют важную роль.

«Может быть, это поможет решить, какие меры лучше подходят для одной группы, чем для другой», — говорит Зогби.

«Дальнейшие исследования также должны включать большее количество белков», — говорит Мерлин Батлер, профессор психиатрии и педиатрии Канзасского университета в Канзас-Сити, который не принимал участия в этой работе.

«Им необходимо охарактеризовать, являются ли мутации PTEN очень серьезными изменениями, когда белок поврежден, или менее серьезными, когда белок все еще функционирует», — говорит Батлер.«Но это хорошая отправная точка».

Исследователи разрабатывают новый высокоселективный инструмент для изучения «не поддающихся обработке» белков через сахара, от которых они зависят

Сахар называют «злым», «ядовитым» и «ядовитым».«Но организму тоже нужен сахар. Молекулы сахара помогают клеткам распознавать вирусы и бактерии и бороться с ними, перемещают белки от клетки к клетке и обеспечивают функционирование этих белков. Слишком много или слишком мало может способствовать возникновению ряда заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания. как болезнь Альцгеймера, воспаление, диабет и даже рак.

Около 85 процентов белков, включая те, которые связаны с болезнями Альцгеймера и Паркинсона, недоступны для существующих лекарств.Один критически важный и обильный сахар (O-GlcNAc, произносится как o-glick-nack) обнаружен в более чем 5 000 белков, часто считающихся «неподдающимися обработке». Но теперь исследователи из Гарвардского университета разработали новый высокоселективный карандаш и ластик O-GlcNAc — инструменты, которые могут добавлять или удалять сахар из белка без побочных эффектов — чтобы точно изучить, что эти сахара делают, и, в конечном итоге, , разработайте для них новые методы лечения «непреодолимого».

«Теперь мы можем начать изучать определенные белки и посмотреть, что происходит, когда вы добавляете или удаляете сахар», — сказал Даниэль Рамирес, соавтор статьи, опубликованной в Nature Chemical Biology , и доктор философии.Кандидат биологических и биомедицинских наук в Высшей школе искусств и наук. «Это оказывается очень важным при многих хронических заболеваниях, таких как рак, диабет и болезнь Альцгеймера».

Рамирес разработал оригинальный карандаш O-GlcNAc, о котором сообщалось в ACS Chemical Biology .

Все клетки содержат множество сахаров (называемых гликанами), но, как известно, их трудно изучать. Современные инструменты обеспечивают либо широкоугольный обзор (включение или выключение всех O-GlcNAc в клетке), либо ультра-увеличенный обзор (включение или выключение одного сахара на одной аминокислоте на одном белке).Ни одна из этих точек зрения не может показать, что молекулы O-GlcNAc делают с белком в целом, — важнейшее открытие, которое позволило бы исследователям связать точки от O-GlcNAc с болезнью.

«Используя подход на уровне белка, мы восполняем недостающий важный элемент», — сказала Кристина Ву, доцент химии и химической биологии, руководившая исследованием. Инструмент ее лаборатории похож на теплую миску с кашей Златовласки: не слишком широкую, не слишком специфичную. В самый раз.

«Как только у вас появится какой-либо интересующий белок, — сказал первый автор и доктор наук Юн Гэ, — вы можете применить этот инструмент к этому белку и непосредственно посмотреть на результаты». Ge разработал ластик O-GlcNAc, который, как и карандаш, использует нанотело в качестве устройства поиска белка. Инструмент тоже можно адаптировать; пока существует нанотело для выбранного белка, инструмент может быть модифицирован для нацеливания на любой белок, для которого существует самонаводящееся нанотело.

Нанотело является важным компонентом, но у него есть ограничения: остается ли оно прикрепленным к целевому белку, все еще под вопросом, и молекула может изменить функцию или структуру белка, прилипнув.Если клеточные изменения не могут быть окончательно связаны с содержанием сахара в белке, это искажает данные.

Чтобы обойти эти потенциальные ограничения, команда разработала свои карандаши и ластики так, чтобы они были «каталитически мертвыми», — сказал Ву.Кастрированные ферменты не будут вносить нежелательных изменений в свой целевой белок. И они могут как добавлять, так и удалять сахар, в отличие от предыдущих инструментов, которые вызывают постоянные изменения. Конечно, как только они соединяют определенную функцию белка с O-GlcNAc, они могут затем использовать эти инструменты для увеличения и определения точного местоположения этих сахаров, которые захватывают и модифицируют белок.

Некоторые сотрудники лаборатории Ву уже используют комбинацию карандаш / ластик для изучения O-GlcNAc на живых животных.Один, например, использует плодовых мушек для изучения того, как сахар влияет на белок, связанный с болезнью Альцгеймера. Сахар также связан с прогрессированием болезни Паркинсона: «Если вы потребляете меньше глюкозы, — сказал соавтор Рамирес, — тогда вы не сможете производить этот сахар внутри клеток». Это означает, что организм не может прикрепить сахар к белкам, что вызывает широкомасштабные изменения в клетках, усугубляя болезнь. При диабете избыток сахара вызывает аналогичные глобальные нарушения; и раковые клетки, как правило, едят много сахара.Теперь, с помощью пары карандаш / ластик лаборатории Woo, исследователи могут точно определить, как эти сахара влияют на различные белки, и приступить к разработке лекарств, чтобы обратить вспять негативные эффекты.

Затем команда планирует настроить свой инструмент, чтобы добиться еще большего контроля. Например, с помощью оптогенетики они могут включать и выключать сахар с помощью вспышки света. Заменив нанотела на небольшие молекулы (используемые в традиционном дизайне лекарств), они могли приблизиться к новым методам лечения. Они также разрабатывают ластик для ластика — инструмент с выключателем — и планируют включить нанотела, которые могут нацеливаться на естественный белок (для этого исследования они пометили белки, чтобы нанотело могло их найти).«Мы в основном пытаемся сделать систему более естественной и работать так же, как клетка», — сказал Рамирес.

Ву также планирует исследовать, как O-GlcNAc может влиять на традиционно «неподдающиеся обработке» белки, называемые факторами транскрипции, которые включают и выключают гены. Если O-GlcNAc играет роль в этом процессе, сахара также могут быть созданы для изучения и регулирования функции генов.

«Мы действительно не знаем, что люди найдут, когда мы дадим им эти инструменты», — сказал Рамирес.Инструмент может быть новым, но потенциал огромен: «В основном мы работаем с iPhone, — продолжил он, — но мы уже работаем над следующими двумя поколениями».

Ссылка : Исследователи разрабатывают новый высокоселективный инструмент для изучения белков, не поддающихся обработке, через сахара, от которых они зависят (2021, 11 марта) получено 22 марта 2021 г. с https: // физ.org / news / 2021-03-высокоселективный-инструмент-undruggable-protein-sugars.html

Этот документ защищен авторским правом.