Протеинов: Виды протеинов и их различия в спортивном питании — интернет-магазин Чиф и Шериф

Содержание

Подбор лучшего протеина. Сравнение протеинов и какой лучше выбрать

Многие слышали или читали о пользе спортивных добавок. Наиболее известный вариант – протеин, который существует в разных формах и вариантах добавок.

Виды

Протеин разделяется на группы, согласно ряду характеристик. Основным критерием считается его происхождение, источник выработки. В сфере спортивного питания возможно найти 3 максимально часто встречающихся белка: сывороточный, казеин и соевый. Из этих 3 видов молочная сыворотка считается самой популярной.

Перед выбором протеина спортсмены обращают особое внимание на качественные характеристики добавки. На самом деле, качество определить довольно сложно, т.к. на него воздействует множество разных факторов (основную роль играют происхождение ингредиентов и специфика производства). Подобные вещи довольно редко описываются производителями.

Самые лучшие формы сыворотки содержат достаточно высокую долю чистого белка с незначительными примесями лактозы и липидов.

На конечное качество протеина также оказывает влияние концентрация определенных фракций сыворотки. К примеру, определенные виды сывороточного протеина обладают высоким содержанием фракций белка (бета-лактоглобулин). Как правило, он составляет около половины от всех белков в составе сыворотки.

К прочим важным фракциям сыворотки относят альфа-лактальбумин, гликомакропептиды, альбумин, иммуноглобулины, лактоферрин, лактопероксидазу и прочие. Концентрация данных фракций выступает настоящим индикатором качества протеина из молочной сыворотки. При этом искусственное увеличение уровня фракций приводит к повышению общей стоимости добавки.

Отличительные характеристики изолята и концентрата

Многие спортсмены знают, что базовое отличие этих видов протеина – количество чистого белка на 1 г продукта. Изолят – максимально очищенный вариант, который содержит около 90% белка в 1 грамме протеиновой смеси. Концентрат, в свою очередь, характеризуется значительным диапазоном относительно содержания белка в продукте: от 40 до 80%, что влияет на его конечную стоимость.

Важным моментом является порядок перечисления на этикетке различных видов протеина в составе. Если необходима добавка для поддержки анаболических процессов – следует обратить внимание на продукты с повышенным содержанием гидролизата либо изолята молочной сыворотки.

Следует отметить, что на общее качество добавки влияет специфика изготовления протеина. Методики очистки, которые используются для производства чистого белка, значительно улучшились.

Микрофильтрация и ионообменная хроматография

Многие слышали, что молочная сыворотка является продуктом переработки твердого сыра и казеина. Она в большей мере состоит из лактозы и небольшого количества чистого протеина. Поэтому для получения изолята сывороточного протеина, обычная сыворотка должна подвергнуться значительной очистке и переработке. 2 наиболее популярных варианта будут описаны далее. Изолят, полученный в результате, будет иметь совершенно разные свойства.

Микрофильтрация. Данный метод относится к мембранному способу деления. Он подразумевает особое разделение ингредиентов сыворотки под влиянием высокого давления, полупроницаемых мембран и фильтрации. Такой изолят характеризуется более высокой стоимостью.

Сывороточные протеины, как правило, проходят процесс микрофильтрации, поскольку данный механизм позволяет избавиться от множества вредных примесей. Ультрафильтрация и нанофильтрация дают возможность убрать из молочной сыворотки определённые компоненты крупных размеров. Температуры, которые используются во время фильтрации, не могут нарушить биоактивность сывороточного белка. Такой технологический процесс позволяет сделать изолят с искусственно увеличенным содержанием фракций.

Ионообменная хроматография. Его характеризуют как разделение по способу выборочной всасываемости. Такой процесс предполагает катионный или анионный принципы. Часто марки спортивного питания не указывают, какой обмен произошел.

Описывая сывороточный протеин, стоит отметить, что он разделяется на 2 группы: белки основного и неосновного типа. К первой группе стоит относить бета-лактоглобулин, альбумин и альфа-лактальбумин (характеризуются отрицательным зарядом). К неосновной относятся лактоферрин и лактопероксидаза (имеют положительный заряд).

При использовании метода ионообменной хроматографии применяются высокая температура и сверхактивные химические вещества, которые отрицательно влияют на общую ценность изолята.

Однако на сегодняшний день технологии ионообменной хроматографии заметно продвинулись вперед. Это позволило значительно улучшить процесс очищения фракций и пептидов, при сохранении биологическую ценности продукта.

Циклы применения

Эксперты склоняются к выводу, что периодически следует повторять цикл употребления протеина. Возможно принимать протеиновые добавки, которые имеют отличия в типе либо концентрации фракций, факторах роста или доли неосновных протеинов.

Улучшение процесса очищения молочной сыворотки привело к улучшению биологической активности протеина, повышению содержания различных биоактивных фракции, природных пептидов. Приобретая добавки, не забывайте изучать этикетку для подбора качественного варианта.

Самая эффективная экстракция протеинов с Flottweg

Декантеры и Седикантер® компании Flottweg — оптимальное решение для получения протеинов из различного сырья. Наши установки выделяют ценные протеины из растений. При этом мы предлагаем Вам подходящую промышленную центрифугу, подходящую для любой стадии производственного процесса: экстракции, промывки, сгущения и осветления. Цель — получение из растений максимального количества протеинов наилучшего качества. 

Получение протеинов на самом высоком уровне

  • высокий выход протеинов,
  • соблюдение строгих санитарных норм,
  • бережная переработка продукта,
  • низкое энергопотребление.

Растительное сырье как источник протеинов

Соевый протеин и концентрат соевого белка

Соевые бобы содержат около 40% растительного белка высочайшего качества. Из большинства сортов соевых бобов производится соевое масло. Оно служит в качестве основы для производства продуктов питания или биодизеля. Соевый белок можно экстрагировать в виде концентрата и изолята.

Гороховый протеин

Горох является не только источником белка. Также большое значение он имеет и для получение крахмала. Оба этих ценных вещества необходимо выделять с максимальной эффективностью.

Люпиновый протеин

Люпины являются ценным источником белка. Такой белок отличается высочайшим качеством и находит применение, например, в виде пищевых добавок или кормов для животных.

Рапсовый протеин

Растение рапса после цветения образует стручки, в которых находятся семена. Каждое из этих семян содержит до 40% масла. Его можно извлечь при помощи промышленных центрифуг. Остающийся после этого рапсовый шрот используют в качестве корма в животноводстве. 

Процесс получения протеинов с помощью центрифуг Flottweg

Компания Flottweg предлагает лучшее решение для получения протеинов

Декантеры и Седикантер® Flottweg обладают рядом отличительных особенностей:

Регулируемый диск разделения фаз

Отведение очищенной фазы осуществляется посредством регулируемого диска разделения фаз. Это позволяет регулировать содержание сухого вещества и чистоту фугата в зависимости от поставленной задачи.

Гигиеничный дизайн

Наши установки соответствуют всем санитарным нормам и оптимально подходят для получения растительных протеинов.

Привод Simp Drive® компании Flottweg

Этот привод автоматически адаптируется к различным уровням нагрузки и обеспечивает оптимальное значение СВ в выгружаемом осадке.

 

Хотите повысить производительность и улучшить качество при выделении протеина? Узнайте больше о декантерах и Седиканторе®. Эксперты Flottweg охотно ответят на Ваши вопросы. Свяжитесь с нами!

%d0%Bf%d1%80%d0%be%d1%82%d0%b5%d0%b8%d0%bd%d0%be%d0%b2 - English translation – Linguee

На грузовики могут устанавливаться зарубежные

[...]

дизели Perkins мощностью 65 л.с. (базовый

[...] двигатель) и Deutz BF 04L 2011 мощностью [...]

79 л.с. или отечественный владимирский

[...]

ВМТЗ Д-130Т мощностью 65 л.с. Приводы от валов отбора мощности спереди и сзади позволяют навешивать различное дополнительное оборудование.

trucksplanet.com

The trucks can be equipped with foreign

[...]

Perkins 65 hp diesel (Base engine) and Deutz BF 04L 2011 with

[...] an output of 79 hp or domestic VMTZ D-130T [...]

developes 65 hp.

trucksplanet.com

Параметр bf содержит файл, который [...]

клиент должен получить по TFTP; подробности смотрите в Разд. 4.5.4.

debian.org

The “bf” option specifies the [...]

file a client should retrieve via TFTP; see Section 4.5.4 for more details.

debian.org

Если заготовка имеет важное значение в стране, то

[...]

составителям кадастров рекомендуется использовать национальные

[...] данные по заготовкам или вывести значение BF по конкретной стране.

ipcc-nggip.iges.or.jp

If logging is significant in the

[...] country, the inventory compilers are encouraged to use national [...]

harvest data or derive country-specific BF values.

ipcc-nggip.iges.or.jp

BD
в
ыпускается в строгом соответствии с техническими условиями, все аудио могут быть расшифрованы вывода см. в разделе BD RIP, BD ISO треков были совершенны следующего поколения выходе источника

macbook-covers.net

BD produced in strict accordance with specifications, all the audio can be decoded output, see BD RIP, BD ISO tracks were perfect the next generation of source output

macbook-covers.net

Если бы Володя Малахов, до этого очень здорово

[...] игравший ту партию, пошел Bf5 c Ефименко, то мы [...]

бы выиграли тот матч, вышли на чистое первое

[...]

место, и, что очень важно, поменялись бы с украинцами местами психологически.

crestbook.com

If Volodya Malakhov, who had played that game extremely well until

[...] then, had gone for Bf5 against E
fimenko [...]

then we’d have won the match, moved into

[...]

clear first place and, very importantly, switched places with the Ukrainians psychologically.

crestbook.com

Эта опция меню будет доступна после установки CD/DVD/BD-ROM-привода в NMT, или при подключении внешнего USB-привода CD/DVD/BD-ROM.

popcornhour.es

This option will only be accessible when a CD/DVD/BD-ROM drive has been installed into or attached to your NMT.

popcornhour.es

Изъятие древесины (L древ.-изъятия ) рассчитывается с помощью уравнения 2.12 из главы 2, товарные круглые лесоматериалы с корой (H), коэффициент преобразования и

[...]

разрастания биомассы (BCEF ), доля

[...] коры в заготовленной древесине (BF), отношение подземной биомассы [...]

к надземной биомассе (R), доля

[...]

углерода в сухом веществе (CF) и табличные данные по умолчанию, раздел 4.5.

ipcc-nggip.iges.or.jp

Wood removal (L wood-removals ) is calculated with Equation 2.12, Chapter 2, merchantable round wood over bark (H), biomass conversion expansion factor (BCEF ), bark

[...]

fraction in harvested wood

[...] (BF), below-ground biomass to above-ground biomass ratio (R), carbon [...]

fraction of dry matter (CF)

[...]

and default tables, Section 4.5.

ipcc-nggip.iges.or.jp

В Институте агротехники и животноводства Баварского земельного управления сельского хозяйства вот уже много лет

[...]

используются инкубаторы с принудительной

[...] циркуляцией воздуха серии BF от BINDER, благодаря [...]

которым качество исследований остается

[...]

неизменном высоким.

binder-world.com

At the Institute for Agricultural Engineering and Animal Husbandry at the Bavarian State Research Center for Agriculture,

[...]

incubators with mechanical convection of the BF

[...] series from BINDER have supported the consistently [...]

high quality of research for many years.

binder-world.com

Добавить код BF к соответствующим номерам [...]

заказов муфт и ниппелей.

staubli.com

Add the code BF to the concerned part-numbers [...]

of the sockets and the plugs.

staubli.com

влажность,W; —коэффициент биоразложения отходов на стадии

[...] полного метаногенеза Bf (зависит от морфологического [...]

состава биоразлагаемой части ТБО).

ogbus.com

factor of biodecomposition of waste products at the stage of complete

[...] formation of methane Bf (depends on morphological [...]

structure of biodecomposing part of MSW).

ogbus.ru

Хотя

[...] Me.410 превосходил Bf.110 по лётно-техническим [...]

характеристикам, прежде всего по скорости и дальности полёта, но всё

[...]

же уступал ему в универсальности применения.

warthunder.com

Although the Me.410 was

[...] superior to the Bf 110 in its performance [...]

characteristics, most of all in its speed and flight range,

[...]

it was inferior as far as versatility was concerned.

warthunder.com

Она весит 13 т и может перевозить до 2 т

[...]

груза с помощью установленного

[...] дизельного двигателя Deutz BF 6L 913 мощностью 160 [...]

л.с. или GM 4-53T мощностью 175 л.с. Колеса

[...]

амфибии имеют диаметр 2.96 м и ширину 1.5 м. Скорость на суше 8 км/ч, на воде - 5 км/ч. На палубу амфибии может приземляться небольшой вертолет, а чтобы амфибия не перевернулась от воздушных потоков, создаваемых лопастями вертолета, предусмотрена система 4х якорей, фиксирующих VARF.

trucksplanet.com

Weighing a total of 13 t, 2 t payload, it was powered by a

[...] Deutz BF 6L 913 160 hp or GM 4-53T 175 hp engine [...]

with wheels of 2.96 m diameter and

[...]

1.5 m wide. Speed of 8 km / h on land and 5 in water.

trucksplanet.com

Светодиоды "R", "BF", "FDO" и "FS" не являются [...]

элементами системы обеспечения безопасности и не должны использоваться в

[...]

качестве таковых.

download.sew-eurodrive.com

The "R", "BF", "FDO" and "FS" LEDs are not safety-oriented [...]

and may not be used as a safety device.

download.sew-eurodrive.com

Страхование типа "Bf" и "Cf" подготовила EGAP [...]

при тесном сотрудничестве с банковским сектором с целью позволить банкам оперативно

[...]

реагировать на потребности своих клиентов, а экспортёрам позволить получить от продажи экспортных дебиторских задолженностей финансовые средства для реализации последующих контрактов.

egap.cz

The insurance of the types "Bf" and "Cf" has been prepared [...]

by EGAP in close cooperation with the banking sector with aim

[...]

of enabling banks to react flexibly to needs of their clients and helping exporters to acquire financial funds for realization of further contracts by selling of their export receivables.

egap.cz

ELSR-M-BF/AF облегченная версия [...]

саморегулирующийся нагревательный кабель, включающий внешнюю оболочку, которая безопасна

[...]

для использования с пищевыми продуктами и питьевой водой.

eltherm.com

ELSR-M-BF/AF is the light version [...]

of a self-regulating heating cable featuring an outer jacket which is KTW-proofed and

[...]

suitable for use in potable water.

eltherm.com

В 2000 году, проработав около года на должности начальника отдела обслуживания и продаж в подразделении Olympus France, он вернулся в компанию Olympus Medical Systems Europa GmbH в Гамбурге, заняв пост начальника отдела GI/EUS/BF и подразделения маркетинга услуг.

olympus.com.ru

In 2000, after spending about a year as Department Manager, Service & Sales Management with Olympus France, he returned to Olympus Medical Systems Europa GmbH in Hamburg to take on the role of Department Manager GI/EUS/BF and Service Marketing Division.

olympus.it

Выполнен проект по изготовлению пилотных

[...]

образцов портативного мультимедийного проигрывателя, использующего разнообразные

[...] аудиоинтерфейсы, на процессоре Blackfin BF548.

promwad.com

The project for the pilot samples production of the portable

[...]

multimedia players that use different audio interfaces and

[...] are based on Blackfin BF548 processor was successfully [...]

completed.

promwad.com

SF1605x400 обработанной винт мяч

[...] шариковинтовая SF типа обрабатываемой в соответствии с BK12 и BF/FF12 опор ШВП.

zappautomation.co.uk

The SF1605x400 machined ball screw is

[...] the SF type ballscrew machined to fit the BK12 and BF/FF12 ballscrew supports.

zappautomation.co.uk

Во-вторых,

[...] использовать VAV BF типа низкого шума [...]

ветра шасси используется в основном для различных кондиционеры, воздушные

[...]

завесы, отопления и охлаждения, вентилятор и т.д., также могут быть использованы в промышленных и горнодобывающих предприятий, общественных мест, крытый вентиляции.

ru.shyngda.com

Second, use VAV BF type low-noise wind [...]

chassis is mainly used for a variety of air conditioning units, air curtain, heating

[...]

and cooling fan, etc., can also be used in industrial and mining enterprises, public places, indoor ventilation.

en.shyngda.com

Чтобы привести автомобиль в боевую готовность и показать силу были использованы 3-дюймовые навесы и особые

[...]

колеса матового черного цвета, а также

[...] грязевые шины М/Т BF Goodrich, был добавлен [...]

большой передний кенгурятник, ограничительная

[...]

планка и багажник на крыше.

ms-auto.co.jp

To be fully armed and show the impact, 3 inch lift ups and

[...]

special mat black wheel and BF Goodrich

[...] mud terrain tires, large front grill guard [...]

and tail guard and roof racks are added.

ms-auto.co.jp

Мы также добавили черные боковые пороги, 2-дюймовый

[...]

навес, эксклюзивные колеса черного цвета и всесезонные

[...] грязевые шины BF Goodrich для придания [...]

более неустрашимого вида.

ms-auto.co.jp

We also added black side tube step, 2 inch lift up, exclusive black color

[...] wheel and BF Goodrich mud terrain tire [...]

to make it with a look of fearless determination.

ms-auto.co.jp

Поскольку пропорциональная

[...] счетная трубка BF3 будет реагировать [...]

только на термальные нейтроны, полиэтиленовый модератор,

[...]

который замедляет случайные быстрые нейтроны до термальных энергий, окружает нейтронно чувствительную трубу.

ru.flukebiomedical.com

Since the BF3 proportional counter [...]

tube will only respond to thermal neutrons, a polyethylene moderator, which slows the

[...]

incident fast neutrons to thermal energies, surrounds the neutron sensitive tube.

flukebiomedical.com

В настоящий момент компания

[...] [...] Promwad работает над системой видео наблюдения и регистрации с использованием стандарта сжатия изображения JPEG2000 на базе кодека ADV212/202 и двухъядерного процессора Blackfin BF561.

promwad.com

Currently Promwad Company develops a video surveillance and recording system using JPEG2000 image compression standard based on ADV212/202 codec and Blackfin BF561 duo core processor.

promwad.com

I. Общие сведения о Шанхае должен достичь Фан-Ко,

[...] дизайн и производство BF VAV низким шасси шум [...]

ветра предназначены для вентилятора выхлопных

[...]

устройств для удовлетворения оперативных потребностей различных рабочих условиях, он имеет небольшой размер, легкий вес, красивый внешний вид, низкий уровень шума, простота в обслуживании.

ru.shyngda.com

I. Overview of Shanghai should reach a Fan Co., the design and

[...] production of the BF VAV low noise wind chassis [...]

designed for the blower exhaust devices

[...]

to meet the operational requirements of different working conditions, it has a small size, light weight, beautiful appearance, low noise, easy maintenance.

en.shyngda.com

Наряду со страхованием кредита на инвестиции мы наше предложение расширили на два следующих страховых продукта для страхования

[...]

просроченных задолженностей по экспортным

[...] поставочным кредитам (вид Bf и Cf), которые позволяют [...]

банкам откупать экспортные задолженности

[...]

без регресса на экспортера.

egap.cz

Simultaneously with insurance of a credit for the financing of investments, we extended our offer by two other insurance products for

[...]

insurance of ceded receivables from export

[...] supplier credits (types Bf and Cf) which enable [...]

banks to purchase export receivables

[...]

without recourse against the exporter.

egap.cz

Оборот

[...] компании Manitou BF, специализирующейся [...]

только на подъемных машинах, превысил миллиард евро (более 15 миллиардов

[...]

эстонских крон) в год.

intrac.ee

The turnover of Manitou BF, who is focused [...]

only on lifting machines, is over one milliard euro (more than 15 milliard Estonian kroons ) a year.

intrac.ee

Для учета коры в изымаемой при заготовке древесине необходимо использовать «долю коры в заготовленной древесине» (BF).

ipcc-nggip.iges.or.jp

Bark fraction in harvested wood (BF) should be 4.33 applied to account for bark in wood removals with harvest.

ipcc-nggip.iges.or.jp

BFC продолжает тесно сотрудничать с BFМ для обеспечения максимальной координации деятельности [...]

с подразделениями на местах.

unesdoc.unesco.org

BFC continue to work closely with BFM to ensure maximum coordination with the field offices.

unesdoc.unesco.org

Определение содержания остаточного протеина А в терапевтических препаратах на основе протеинов и антител

На главную / Новости / Определение содержания остаточного протеина А в терапевтических препаратах на основе протеинов и антител

24.10.2019

Протеин А широко используется для хроматографической очистке иммуноглобулинов на производстве и в научных лабораториях. Но, вместе с тем, наличие протеина А является критическим показателем при производстве терапевтических антител и протеинов. Классические методы определения наличия протеина А (ИФА и ВЭЖХ) занимают много времени и имеют ограничения по применению в производственных условиях.

Набор Residual Protein A, ForteBio позволяет определить даже следовые количества протеина А в препаратах после их очистки. Набор предназначен для анализа остаточного протеина А методом BLI с применением систем Octet, ForteBio. Преимущество технологии BLI в том, что для проведения анализа с использованием систем Octet не требуется выделение или дополнительные манипуляции с образцами. Этот подход, в совокупности с 96-луночным форматом, позволяет существенно ускорить процедуру анализа.

Набор для определения остаточного белка A (RPA) ForteBio обеспечивает чувствительность для точного измерения до 100 пг / мл загрязняющего белка A в образцах, содержащих до 5 мг / мл антитела и совместим со всеми системами Octet, за исключением Octet K2.

Дополнительная информация:
Анализ остаточного Протеина А с применением системы Octet, ForteBio, англ. 11 стр.



Фильтр

Цена в валюте производителя / в рублях

18-5081

130 840,=

1 436,= EUR

18-5128

88 398,=

970,= EUR

OCTET QKE

Высокочувствительная система Octet QKE позволяет проводить характеризацию малых молекул, а также производить фрагментный анализ белков. Анализ до 8 образцов одновременно, с загрузкой из 96-луночного планшета.

Система Octet QKE обеспечивает широкий динамический диапазон измерения (от 0,05 мкг / мл IgG), диапазоном kD от 0,1 мМ до 0,1 нМоль.

В число популярных промышленных применений Octet QKE входят скрининг экспрессии кодирующих генов, скрининг эпитопного взаимодействия антиген-антитело, а также оценка клеточных линии для оптимизации процесса культивирования на производстве. Система Octet QKE идеальна как для аналитических лабораторий, где занимаются исследованиями структуры и функций белка, так и для небольших частных лабораторий, занимающихся скринингом белков массой от 5кДа.

Технические характеристики:

  • диапазон аффинности — от 0,1 мМ до 0,1 нМоль;
  • молекулярный вес анализируемых белков — от 5000 Да;
  • минимальный объем пробы — 0,2 мл;
  • количество одновременно измеряемых образцов — 8;
  • формат загрузки образцов — 96 луночный планшет;
  • совместимость с роботизированными системами — нет;
  • возможность многостадийных исследований — да;
  • габариты, Ш × Г × В, см — 43 × 53 × 47;
  • вес, кг — 24,5.

Отправьте заявку на бесплатное тестирование оборудования Сергею Ирхину sirkh[email protected]

Изучение кинетики связывания и определение аффинности с использованием технологии BLI (видео).
Аналитические системы Octet, ForteBio (Pall), брошюра, англ, 9 стр.
Анализ взаимодействия антител FcRn с помощью систем Octet, ForteBio (Pall), англ., 13 стр.
Кинетический анализ связывания антител с мембранным протеином, ForteBio (Pall), англ., 5 стр.

OCTET HTX

Высокочувствительная и высокопроизводительная система изучения и характеризации как крупных, так и малых молекул с использованием технологии BLI, обладающая высочайшей пропускной способностью.

Система Octet HTX оснащена автозагрузчиком на 2 планшета по 96 или 384 лунки и 96-канальным детектором, что позволяет анализировать до 96 образцов одновременно, обеспечивая высочайшую производительность.

Технические характеристики:

  • диапазон аффинности – от 1 мМ до 10 пМоль;
  • молекулярный вес анализируемых белков – от 150 Да;
  • минимальный объем пробы – 0,04 мл;
  • количество одновременно измеряемых образцов – 96;
  • формат загрузки образцов – 2 планшета 96 или 384 лунки;
  • совместимость с роботизированными системами – да;
  • возможность многостадийных исследований – да;
  • габариты, Ш х Г х В, см – 80 х 80 77;
  • вес, кг – 90.

Отправьте заявку на бесплатное тестирование оборудования Сергею Ирхину [email protected]

Изучение кинетики связывания и определение аффинности с использованием технологии BLI (видео).
Аналитические системы Octet, ForteBio (Pall), брошюра, англ, 9 стр.
Анализ взаимодействия антител FcRn с помощью систем Octet, ForteBio (Pall), англ., 13 стр.
Кинетический анализ связывания антител с мембранным протеином, ForteBio (Pall), англ., 5 стр.

OCTET RED384

Высокочувствительная и высокопроизводительная система анализа и характеризации крупных молекул с использованием технологии BLI, обладающая возможностью интеграции в автоматизированную линию.

Octet RED384 имеет 16 каналов измерения и автозагрузчик на 2 планшета формата 96 или 384 лунки, что обеспечивает повышенную производительность.

Высокая чувствительность и высокая пропускная способность системы Octet RED384 делают её фаворитом для скрининга небольших библиотек белковых молекул и анализа матриц молекул белков.

Технические характеристики:

  • диапазон аффинности – от 1 мМ до 10 пМоль;
  • молекулярный вес анализируемых белков – от 150 Да;
  • минимальный объем пробы – 0,04 мл;
  • количество одновременно измеряемых образцов – 16;
  • формат загрузки образцов – 2 планшета 96 или 384 лунки;
  • совместимость с роботизированными системами – да;
  • возможность многостадийных исследований – да;
  • габариты, Ш х Г х В, см – 80 х 80 77;
  • вес, кг – 68,2.

Отправьте заявку на бесплатное тестирование оборудования Сергею Ирхину [email protected]

Изучение кинетики связывания и определение аффинности с использованием технологии BLI (видео).
Анализ взаимодействия антител FcRn с помощью систем Octet, ForteBio (Pall), англ., 13 стр.
Аналитические системы Octet, ForteBio (Pall), брошюра, англ, 9 стр.
Кинетический анализ связывания антител с мембранным протеином, ForteBio (Pall), англ., 5 стр.

Роль протеина в рационе молочного скота

Белки синтезируются из аминокислот, которые попадают в кровоток как конечные продукты пищеварения, или образуются в процессе обмена веществ. Для синтеза специфических белков организма необходимо иметь все необходимые аминокислоты. При этом часть из них может в достаточном количестве синтезироваться непосредственно в самом организме, а другая часть — так называемые незаменимые аминокислоты — должна поступать с кормами. Незаменимыми аминокислотами являются лизин, триптофан, гистидин, лейцин, метионин и другие. В зависимости от содержания в кормах заменимых и незаменимых аминокислот различают полноценные и неполноценные белки. Полноценными являются соединения, содержащие весь перечень незаменимых аминокислот — это почти все белки животного происхождения и некоторые растительные. А еще в полноценном белке заменимые и незаменимые аминокислоты должны быть подобраны в оптимальном соотношении. Полноценность белка влияет на степень его использования организмом животного. Для этого используют понятие биологической ценности белка. Этот показатель характеризует, сколько протеинов собственного тела может образоваться из 100 г протеина, содержащегося в корме. Согласно упомянутой характеристикой ценность кормов животного происхождения достигает 75-95%, а растительных белков — 60-65%.

Эффективность использования растительного белка животными очень разная — 8-45%. Она зависит от вида, возраста, кормления скота, его производительности, а также биологической полноценности корма. Для кормления жвачных протеин играет очень важную роль. Чтобы лучше понимать роль белка в рационе, следует определить основные понятия, характеризующие протеиновую питательность корма. Сама протеиновая питательность является показателем способности корма удовлетворять потребности животных во всех необходимых заменимых и незаменимых аминокислотах. Прежде такую питательность определяет сырой протеин (ХР) корма, который объединяет все азотсодержащие соединения органического и неорганического происхождения.

Сырой протеин

Он состоит из белков и амидов. Белки — это высокомолекулярные соединения, состоящие из аминокислот. Амиды — это азотсодержащие соединения небелкового характера. А еще к ним относят самые свободные аминокислоты, соли аммония, нитраты и нитриты, нуклеиновые аминокислоты, а также свободные короткоцепные полипептиды. Содержание азота в амиде может быть от 7 до 21%, что определяет их ценность. При этом высокое содержание амидов наблюдается в молодых зеленых растениях при активном фотосинтезе. Также их становится больше в сыром протеине при хранении корнеплодов. Если высокое содержание солей аммония, нитратов и нитритов может вызвать отравление у многих животных, то жвачные способны утилизировать эти соединения с помощью микроорганизмов рубца. Вобщем содержимое сырого протеина можно определить, умножив общую концентрацию азота на коэффициент 6,25. Рекомендуемая доля сырого протеина в рационе дойных коров может быть от 12% для животных во время сухостойного периода, до 18% — для коров в период ранней лактации.

Переваримый протеин

Это доля сырого протеина, которая всасывается в кровь и лимфу из пищеварительного тракта. Таким образом, этот показатель характеризует потери общего объема азота из пищеварительного тракта, но не позволяет определить, в какой именно форме был усвоен азот — в виде аммония или аминокислот.

Протеин, который расщепляется в рубце

Он является частью сырого протеина корма, которая расщепляется в преджелудках жвачных под действием ферментов, выделяемых микроорганизмами. В рубце протеины расщепляются до аммиака и летучих жирных кислот, а глубина расщепления зависит от физических и химических свойств соединений. Эти показатели различных кормов значительно отличаются, а потому по содержанию протеина, который расщепляется в рубце, корма могут быть очень разными. Например, обычная соевая мука содержит достаточно много расщепляющихся в рубце белков. В результате большую часть высвобожденных аминокислот легко использует рубцовая микрофлора, и значительно меньше попадает в тонкий кишечник.

Байпасный протеин

Этот протеин не расщепляется в рубце (UDP) и без значительных изменений перемещается в кишечник, распадаясь там на аминокислоты. Так, рационы для жвачных с большим содержанием кукурузного глютена или клейковины или кокосовой муки уже содержат такие трудноперетравимые белки. Наибольший эффект от таких кормов бывает тогда, когда в рационе используют большое количество легкоперетравных несложных кормовых средств, а также источников высокоперетравных углеводов. Благодаря специальной обработке сырья можно успешно повлиять на растворимость белка в рубце, чтобы большая его часть попадала в кишечник. Потому увеличение содержания аминокислот в тонком кишечнике повлияет на увеличение надоев. В частности, согласно результатам исследований британских ученых, использование «защищенной» сои приводит к повышению молочной продуктивности на 6,5-7,5%. Исследователи также выяснили, что «защищенная» соя положительно влияет на воспроизводительную функцию у коров, прежде стимулируя работу яичников. Кроме сои, распространенным «защищенным» сырьем является рапс и люпин. По данным российских ученых, благодаря использованию «защищенных» протеинов можно увеличить продуктивность в среднем на 4% (от 5 до 13%) и одновременно уменьшить использование комбикормов на 1 литр молока до 6-11%. К тому же тепловая обработка белков в определенных температурных режимах делает их менее растворимыми в рубце, но не нарушает их способности к распаду в сычуге и кишечнике, а значит, не мешает работе рубца, сохраняет здоровье и продуктивность животных.

Растворимость и усвояемость протеина

Растворимость протеина — это способность белковых и небелковых азотистых веществ корма растворяться в жидкости рубца. При этом чем лучше растворимость протеина, тем больше его расщепляемость в рубце. Содержание растворимого протеина в корме также зависит от физических и химических свойств азотистых соединений. На превращение белков в организме влияют три основных фактора: расщепляемость соединений в рубце, количество и качество созданного микробного белка, а также количество белка, который попадет в кишечник. Следует помнить, что количество белка, которое корова потребила с кормом, практически ничего не говорит о реальном обеспечении животного протеином. Единицей определения потребности коров в нем, а также показателем, характеризующим обеспеченность им рациона, является усвоенный в кишечнике протеин (nXP). Он состоит из протеина, а не расщепленного в рубце, а также микробного протеина, который образовался в рубце и потом попал в кишечник. Он показывает, сколько протеина будет доступно в тонком кишечнике с учетом имеющейся в корме энергии и количества протеина, нерасщепленного в рубце. Этот показатель является расчетным. Следует помнить, что часть этого белка идет для удовлетворения потребностей собственного тела, а часть необходима для соответствующей производительности.

Особенность белкового обмена жвачных

У жвачных животных расщепление протеина с образованием аммиака происходит в рубце, а сам аммиак частично идет на то, чтобы в печени образовывалась мочевина (всасываясь в кровоток через стенки рубца), а частично используется микроорганизмами для синтеза белка бактериального происхождения. Причем мочевина может также повторно использоваться микрофлорой рубца, поворачиваясь к нему вместе со слюной или всасываясь обратно через стенку. Часть мочевины выводится с мочой, и это можно четко регулировать. Например, в рационах с низким содержанием сырого протеина основная доля мочевины используется повторно и только небольшая часть теряется с мочой. То время, когда в рационе увеличить содержание сырого протеина, большая часть мочевины выводится из организма и лишь незначительная доля используется повторно. К тому же для питания животных как частичные заменители белка могут использоваться и небелковые азотистые продукты, а синтез микрофлорой рубца необходимых незаменимых аминокислот устраняет необходимость контроля за их содержанием в рационе. Для кормления молочного скота основными являются такие аминокислоты, как метионин, триптофан и лизин.

Переваривание белковых соединений жвачными — это очень сложный процесс со многими промежуточными звеньями. Сначала в рубке белки гидролизуются и расщепляются на составляющие аминокислоты. Затем эти аминокислоты дезаминируются с образованием аммиака и жирных кислот. При этом скорость этого протеолиза в рубце напрямую зависит от растворимости белков в соке рубца. Например, только около 15% белка с силосованного корма попадает в тонкий кишечник непереваренным. Что касается других кормов, то этот показатель может быть в пределах 20-40%. Таким образом, жвачные животные усваивают 60-80% азота именно в рубце. При этом важную роль играет рубцовая микрофлора, в результате чего животные обеспечиваются высокопереваримыми источниками протеинов. В среднем с 1000 г переваренных органических азотсодержащих соединений образуется около 130 г микробного белка, который содержит все необходимые незаменимые аминокислоты. То есть, в зависимости от усвояемости рациона, синтез бактериального белка может быть в пределах 400-1500 г в день. Это, в свою очередь, дает возможность на 60-90% обеспечивать потребности жвачных животных в белке именно за счет соединений микробного происхождения. Затем образованный микробный белок с пищей попадает в сычуг и тонкий кишечник в виде отмерших бактерий, где переваривается вместе с нерасщепленным протеином. Из всего протеина, который попадает в тонкий кишечник, переваривается около 80%, а остальные 20% выделяются с навозом. Таким образом, кормовой белок превращается в организме жвачных, во-первых, до образования микробного протеина, во-вторых, до выделения белка, не расщепляется в рубце, и, в-третьих, до выделения углеводного остатка, который возникает в результате дезаминирования.

Баланс азота в рубце

О количественной стороне синтеза и разложения белка в организме свидетельствует баланс азота, а именно разница между азотом, усвоенным организмом, и азотом, которого животные лишились вследствие опорожнения и продуцирования молока или мяса. Чтобы определить баланс белка, полученную разницу по азоту умножают на коэффициент 6,25, потому что содержание азота в белке в среднем составляет 16%. Баланс азота может быть положительным, отрицательным и уравновешенным. Положительный баланс свидетельствует о преимуществе синтеза белка над его распадом (например, как результат роста животных). Отрицательный баланс азота свидетельствует о том, что процессы распада преобладают синтез — это может наблюдаться, например, при вскармливании потомства или изнурительных болезнях. Уравновешенный азотистый баланс характеризует естественное физиологическое состояние здорового взрослого организма, который уже перестал расти. И равновесие может не изменяться даже тогда, когда в рационе будет увеличиваться или уменьшаться содержание протеина. Это наименьшее количество белка в корме, при котором азотистое равновесие еще будет сохраняться, называется белковым минимумом.

При кормлении жвачных очень важен баланс азота в рубце (БАВ). Этот показатель определяет обеспеченность рубцовых бактерий азотом с учетом энергии, содержащейся в корме. Баланс азота в рубце может быть положительным и отрицательным. Причем, если его меньше, это означает, что микроорганизмы рубца имеют достаточно энергии, с помощью которой они могут образовать более микробного белка в том случае, когда с кормом получили больше протеина. Отрицательное значение БАР свидетельствует о том, сколько азота необходимо добавить в рацион, чтобы устранить его нехватку. В свою очередь, положительный баланс азота в рубце не всегда желателен. Это будет зависеть от его доли, потому показатель БАР от 1 до 50 означает достаточную обеспеченность азотом. Когда БАР превышает 50, это его избыток. А вот БАР выше 100 сигнализирует об угрозе развития ацидоза. Для высокопродуктивных коров рекомендуют положительный баланс азота в рубце, желательно на уровне 30-50 г азота ежедневно на корову. Повлиять на уменьшение БАР можно, добавляя в рацион дополнительные источники энергии, которые позволят микроорганизмам рубца использовать для образования микробного протеина большую часть азота в форме аммиака.

Синхронность рациона

Современная наука и практика все убедительнее свидетельствуют о том, что для кормления высокопродуктивных коров очень важно не просто сбалансированность рациона, а его синхронность. Этот термин означает, в какой мере энергия и белок доступны для ферментации рубцовой микрофлорой в любой промежуток времени. В оптимально сформированном рационе высокопроизводительной коровы содержание различных по скорости рубцовой ферментации источников энергии (сахар, различные формы крахмала, клетчатки) должен отвечать определенным источникам протеина с высокой, средней и медленной скоростью расщепления в рубце. Это позволит создать оптимальный и, к тому же еще и стабильный баланс азота в рубце, что поможет рубцовой микрофлоре работать максимально эффективно. Улучшится работа целлюлозолитических бактерий, которые способствуют лучшей переваримости всего рациона. Лучшей будет конверсия корма и полнее реализация продуктивного потенциала животных. Поддержать оптимальный и стабильный азотный баланс рубца может помочь, например, небелковый азот в пористой матрице. По скорости высвобождения азота в рубце он занимает промежуточное место между кормами с быстоперетравным протеином (подсолнечный и рапсовый шрот, а также жмых) и кормами с медленноперетравным протеином (соевый жмых и шрот, пивная дробина).

В целом уровень протеинового питания при кормлении крупного рогатого скота характеризуется двумя основными показателями: количеством граммов переваримого протеина на одну кормовую или энергетическую единицу рациона и протеиновым соотношением. При этом протеиновое соотношение показывает, сколько весовых частей переваренных безазотистых питательных соединений приходится на одну весовую часть переваримого протеина. При исчислении протеинового соотношения переваримый жир умножают на коэффициент 2,25 для уравновешивания безазотистых веществ с энергетической ценностью. Соотношение в пределах 1:6-1:8 считают средним, меньше 1:6 — узким и более 1:8 — широким. Установлено, что лучше переваривания корма у молочного скота происходит при соотношении питательных веществ 1:7. Оптимальное количество переваримого протеина в расчете на 1 кормовую единицу зависит от продуктивности коров и может быть в пределах 95-110 г и даже больше. Эффективным считается содержание доступного сырого протеина на уровне 160-180 г на килограмм сухого вещества. К тому же качество протеинов зависит не только от их аминокислотного состава, но и от физико-химического состояния соединений. Здесь важным является количество водосолерасщепляемых фракций, которые быстро перевариваются и используются микроорганизмами рубца. Оптимальным считается содержание водосолерасщепляемых фракций в сыром протеине на уровне 45-55%.

Роль небелковых азотистых соединений

В протеиновом обмене очень важную роль играет печень, где происходит синтез определенных специфических белков, которые попадают в нее с кровью, а их часть расщепляется с образованием безазотистых остатка и аммиака. Тот безазотистый остаток затем может использоваться для синтеза углеводов, а аммиак превращается в мочевину и выводится из организма. При этом питательность аминокислот и амидов разная. Так, аминокислоты по питательности приближаются к белку, тогда как питательность амидов аминокислот будет меньше. Амидами богаты зеленые корма, силос, корнеплоды, где их может приходиться до 25-30% и даже больше общего количества протеина. В противоположность этому белок в концентрированных кормах представлен преимущественно аминокислотными белками. Результаты исследований, к тому же, говорят, что очень важно соотношение между белковыми и небелковыми азотистыми соединениями. При этом наибольшая активность микроорганизмов в преджелудках тогда, когда на одну часть амидов приходится две-три части белка. Поэтому питательные вещества корма усваиваются лучше. Признание роли небелковых азотистых соединений для кормления жвачных имело очень большое практическое значение. Например, это позволило обосновать возможность использовать в рационах с дефицитом протеина карбамида, углекислого аммония и диамониюфосфата. Впрочем, надо помнить, что положительные результаты использования мочевины для кормления возможны только тогда, когда в рационе достаточно легкоусвояемых углеводов. Они необходимы для успешного размножения и работы рубцовых бактерий. Иначе избыток карбамида может серьезно навредить. Поэтому использование мочевины целесообразным в силосных, силосно-сенажных и силосно-корнеплодных рационах, которые гарантированно содержат много углеводов.

К тому же обязательным условием нормального использования мочевины является обеспечение животных минеральными элементами (особенно фосфором и серой), микроэлементами (кобальтом и медью), а также витамином Д и каротином. Эти соединения являются обязательными предпосылками дальнейшего успешного синтеза микробных протеинов. Чем больше микробного белка образуется в рубце, тем меньше высвобождается аммиака, который меньше всасывается в кровоток через рубцовую стенку. Это положительно влияет прежде всего на воспроизводительную функцию животных, поскольку слишком высокое содержание аммиака в крови может повредить развитию фолликулов и уменьшать способность животных к оплодотворению.

Особенности сырого протеина трав

Молодые зеленые растения содержат много протеина. Поэтому при содержании коров на пастбище потребления сырого протеина значительно возрастает. Сырой протеин из травы характеризуется высокой степенью расщепления в рубце. Поэтому при недостаточном балансировании рациона с большим содержанием зеленых кормов в рубце может накапливаться избыточное количество азота. Этот феномен проявляется в увеличении содержания мочевины в молоке >30-100 мг/мл. Ее наличие в молоке является индикатором избыточного содержания азота в рубце и значительного расщепления аминокислот. Как уже отмечалось, избыток аммиака отрицательно будет влиять на воспроизводительную функцию животных и развитие фолликулов, чем объясняется то, что летом коровы часто отказываются от оплодотворения, особенно когда они находятся на круглосуточном выпасе.

Источники белка и молочная продуктивность

Основной предпосылкой синтеза большого количества микробного белка является соответствующий баланс между переваримого в рубце протеином и доступной энергией из крахмала, сахара или клетчатки, которая необходима бактериям для наращивания собственной белковой массы. Если обеспеченность энергией не соответствует высокому содержанию протеина, переваримого в рубце, большая его часть просто выводиться из организма с мочой, производя на животных неблагоприятное воздействие. Однако если в нужное время в рубце будет достаточно энергии, то большое количество микробного протеина позволит получать высококачественное молоко. Следует заметить, что микробный протеин имеет такой же аминокислотный состав, как и белок молока. Поэтому он легко и очень эффективно трансформируется в этот продукт. Кроме этого, аминокислоты могут также использоваться как энергетическое сырье и становиться базовым материалом для образования молочного сахара. За повышение содержания белка в молоке будут отвечать те аминокислоты, которые будут всасываться в кровь через стенку тонкого кишечника в результате разложения непереваримых в рубце и микробного протеина. При этом низкое содержание белка в молоке даже при скармливании кормов с высоким содержанием протеина и соответствующим белково — энергетическим соотношением может быть связано с двумя причинами. Например, большая часть вскормленного белка была недоступна для расщепления в рубце, потому что не хватает какой-то из аминокислот, необходимой для синтеза молочного белка. С другой стороны, корова, например, может страдать от дефицита энергии в течение раннего периода лактации, когда по сравнению с уровнем потребленного корма, молока образуется слишком много. Тогда животное начинает использовать полученный с кормом протеин для удовлетворения собственных энергетических потребностей. Это достигается расщеплением протеина печенью в энергию и остатки аммиака, превращаться в мочевину и участвовать в дальнейшем обмене веществ.

Также необходимо помнить, что с ростом молочной продуктивности синтез бактериального протеина в рубце становится недостаточным, из-за чего для удовлетворения потребности животных в аминокислотах необходимо привлекать дополнительные источники протеинов, устойчивые к бактериальному разложению. Типичными источниками таких соединений могут быть пивная дробина, барда, а также побочные продукты животного происхождения. С другой стороны, источники небелкового азота можно использовать тогда, когда рацион содержит менее 12% сырого протеина. Распространенным кормовым компонентом, который содержит небелковый азот, является мочевина. Ее советуют использовать с зерном пшеницы, патокой, сеном созревших трав, кукурузным силосом (они содержат много энергии и мало белка и небелкового азота). Мочевину не следует использовать с кормами, богатыми на легкодоступный азот: молодыми злаковыми, зерном бобовых, жмыховой мукой сои. Всего потребление мочевины коровой не должно превышать 150-200 г в день. К тому же с ней следует обращаться очень осторожно, хорошо перемешивать с кормом и равномерно распределять, а также обязательно добавлять в рацион постепенно, чтобы животные смогли привыкнуть.

Протеиновое питание имеет большое значение для предупреждения нарушения обмена веществ и преждевременной выбраковки животных. Например, во многих странах для кормления высокопродуктивного скота молочники широко используют так называемые защищенные белки с низким показателем переваривания в рубце (на уровне 25-30%). Такой белок усваивается на 92-95%. Например, в США доля продуктов с содержанием «защищенного» белка достигает 80%. В отечественных рационах распространенными белковыми компонентами остаются подсолнечный шрот и жом с переваримостью до 97% , а доля «защищенных» белков в рационах не превышает 5-20%. Экономия (т.е. использование сравнительно дешевых кормовых составляющих) негативно влияет на здоровье и продолжительность продуктивного использования животных, вызывает немало проблем с печенью. Хорошим рационом для молочного скота считается тот, в котором протеин хорошо переваривается и имеет оптимальную растворимость в рубце, но при этом удерживается низкая концентрация аммиака и достаточная активность микроорганизмов рубца.

Соотношение протеина, энергии и сухого вещества в кормах

Кормы  
Переваримого протеина/к.ед., г Переваримого протеина/ен.к.ед. (КРС), г Процент переваримог протеина в СВ (КРС)
Трава штучного пастбища 105 83 7,5
Клеверно-тимофеевская смесь 112,5 100 9
Сено разнотравья’я 107 86 6,6
Сено клеверное 150 108 9,4
Сенаж разнотравья 79 65 4,6
Сенаж клеверный 97 86 7,2
Силос кукурузный 70 61 5,6
Трав’яне борошно конюшинне 132 112 10
Солома ярой пшеницы 40 18,4 1,1
Кормовой буряк 75 53 7,5
Зерно ячменя 74 94 12,5
Зерно гороха 163 173 22,6
Подсолнечниковый шрот 374 364 42,9
Цельное молоко 110 122 25,4
Рибная мука 582 497 63,4

Источник: Гродненский государственный аграрный университет

Teradata предлагает инструмент для расшифровки карты протеинов человека. Обзор: Бизнес-аналитика и большие данные в России 2015

Teradata предлагает инструмент для расшифровки карты протеинов человека

После двухсот лет вынужденного ожидания современная наука приступила к изучению совокупности протеинов в человеческом организме. Ученые осторожно мечтают о светлой эпохе без болезней и дряхлой старости, но пока протеомные исследования — это беспрецедентно сложная задача, требующая передовых вычислительных технологий. Ведущие компании в области аналитики больших данных, такие как Teradata, предлагают специализированные решения, которые продвигают протеомику на новый уровень.

Современная наука подошла к важному рубежу: изучению работы всех протеинов в организме человека. Протеины составляют 17% массы человеческого тела. Они строят клетки, управляют биохимическими реакциями, обменом веществ, иммунитетом и почти всеми ключевыми процессами жизнедеятельности организма. Контроль над протеинами — ключ к управлению всем организмом. К сожалению, крайне сложно идентифицировать каждый протеин, выяснить, для чего он используется организмом и как взаимодействует с другими белками. По консервативным оценкам, в организме человека около 22 тыс. протеинов — это 242 млн возможных парных взаимодействий.

Поэтому, хоть протеины были открыты 200 лет назад, до сих пор ученые не могут до конца распутать эту невероятную головоломку. Долгое время технологии позволяли отделить и визуализировать белки, но не идентифицировать их. В то же время даже первые шаги в этом деле дали выдающийся результат. Например, открытие синтетического аналога инсулина ежегодно спасает миллионы людей с диабетом.

Протеомика – передовой край

Протеомика — наука, которая изучает функцию и взаимодействие протеинов в организме человека. В будущем открытия протеомики позволят управлять функциями организма, лечить любые заболевания и продлевать жизнь.

Расшифровка генома человека — перспективное направление, которое на слуху у всех. Но гены — лишь половина картины функционирования организма, ведь гены кодируют множество протеинов. Именно протеины отвечают за подавляющее большинство биологических процессов в организме, например, гемоглобин переносит кислород. При этом до сих пор было неясно, какие гены кодируют определенные протеины. В начале 2015 г. команда Proteomics DB представила первую карту протеинов, кодируемых 18 тыс. генов. Удалось установить, что белковый профиль каждого органа является уникальным. Более того, были обнаружены протеины, которые кодируются вне известной карты ДНК. Еще 2000 протеинов не найдены, хотя и должны существовать в соответствии с генной картой. Возможно, они появляются только в эмбриональном возрасте или связаны с генами, которые «выключились» в ходе эволюции. Все это — терра инкогнита протеомики. Одних только неизвестных протеинов могут быть десятки тысяч. Потенциал протеомики огромен: лекарства от рака, ожирения, старческих болезней, революционные технологии в фармакологии, химической промышленности и многое другое.

Большие данные — главный инструмент протеомики

Сегодня с помощью масс-спектрометрии теоретически можно идентифицировать сотни тысяч протеинов. К сожалению, результаты измерений засорены фоновым шумом, определить массу протеинов можно лишь приблизительно. В итоге для идентификации компьютерный алгоритм выбирает наиболее вероятного кандидата из нескольких измерений со схожими параметрами. Точность анализа протеинов падает с каждым этапом вычислений, поэтому протеомика требует специализированных информационных решений.

Современная масс-спектрометрия поставляет очень большой объем разрозненных данных, которые трудно проанализировать

Другая проблема заключается в том, что погоня за количеством измерений генов и протеинов уже теряет актуальность. Допустим, мы знаем, что при определенной болезни наблюдается экспрессия 10 генов и нарушения в работе 50 протеинов, но они не вызывают заболевания по одиночке. Мы можем обнаружить сотни и даже тысячи генов, связанных с болезнью, но причина болезни так и останется неизвестной. Проще говоря, каждое нарушение следует рассматривать в контексте окружающей геномной и протеомной среды, вплоть до индивидуальных случаев с каждым пациентом. Необходимы комплексные расчеты, чтобы части мозаики сложились в цельную картину работы организма.

Увы, высокопроизводительные алгоритмы анализа, такие как моделирование de novo, дают много ошибок в предсказании функций протеинов. В результате часто менее производительные низкоуровневые расчеты обнаруживают у протеинов неожиданные функции. Нужны новые технологии обработки данных, чтобы наука могла двигаться вперед, а персонализированная медицина стала обычной клинической практикой.

Современный масс-спектрометр генерирует 5-6 Гб данных каждые 100 минут. Один файл первичных данных может содержать более 600 млн точек данных в трех измерениях: время, масса, количество протеинов. Эти данные нужно одновременно проанализировать, сравнить с базой известных протеинов и идентифицировать искомые белки. Серьезные научные проекты, например с 20 круглосуточно работающими масс-спектрометрами, производят петабайты данных. Для анализа этой информации необходимы сложные специализированные решения, которые сочетают высокую скорость и точность.

Наиболее передовое решение подобного рода — это вычислительная платформа Teradata. Она обеспечивает точную обработку данных для протеомики в режиме реального времени с применением массивно-параллельных вычислений (Massively Parallel Processing, или сокращенно MPP).


Воссоздание трехмерной структуры протеинов и их возможных взаимодействий с другими протеинами требует совершенных вычислительных технологий

Платформа использует трехмерную картину данных масс-спектрометрии. Сначала система обрабатывает двухмерные данные (вес и количество протеинов), а затем добавляет третье измерение (время). В итоге формируется 3D-ландшафт с пиками данных, которые сличаются с базой известных или предсказанных протеинов. Аналитические процессы Teradata используют встроенные статистические функции для выполнения сложных задач, например биномиальных разложений, корреляций косинуса и т.д. Преимущество платформы Teradata — быстрое сопоставление базы данных с миллионами возможных комбинаций, включая объединение таблиц. В итоге пользователь в пределах одной платформы получает сквозную, то есть полностью автоматическую, обработку данных масс-спектрометрии.

В некотором смысле решение Teradata восстанавливает дисбаланс между избыточностью данных масс-спектрометрии и нехваткой проанализированных измерений. Ранее сличение данных измерений с базой протеинов было самым медленным процессом протеомики. Теперь с помощью платформы Teradata ученые могут сократить время анализа с дней до часов.

Новая технология позволяет проводить актуальные исследования в области протеомики. Прежде всего, это идентификация основных белков в клетке при сравнении больных и здоровых тканей, прогнозирование реакции на лекарственные препараты, создание трехмерных карт клетки с указанием местоположения белков, изучение локализации протеинов, их взаимодействие. Такие исследования имеют и прикладное значение, например, при раке молочной железы наблюдаются масштабные изменения в субклеточной организации белков. Так, команда Proteomics DB при изучении 24 препаратов против 35 клеточных линий рака обнаружила, что они коррелируют с протеиновыми профилями. Изучение подобных процессов может помочь в разработке новых лекарств.

Помимо этого быстрый протеомный анализ имеет ключевое значение для персонализированной медицины. По мнению руководителя Proteomics DB Бернхарда Кустера (Bernhard Kuster), анализ протеома делает возможным индивидуальный подход к лечению пациентов. Ученый подчеркивает, что детальное знание профиля протеинов опухоли поможет подобрать оптимальные комбинации лекарственных препаратов, а значит, болезнь можно будет лечить на более поздних стадиях и с меньшим вредом для организма.

В конечном счете, протеомика работает на главную цель фундаментальной биологической науки — продление здоровой активной жизни людей. Именно на компьютерных серверах родится ключ к заветной мечте человечества.

Михаил Левкевич

Стимулирующий концентрат на основе протеинов козьего молока / Colodermin Repair Concentrate.

Название :

Стимулирующий концентрат на основе протеинов козьего молока / Colodermin Repair Concentrate.

Описание :

Активный компонент колострум (5%) - уникальный природный концентрат иммуноактивных факторов, биологических стимуляторов и питательных веществ, оказывающих укрепляющее и омолаживающее действие. Экстракт сои стимулирует синтез коллагена, заметно уменьшается глубина морщин, повышают тонус и эластичность кожи. Образует на коже влагоудерживающую пленку, препятствуя трансдермальной потере влаги. Изофлавоны сои оказывают стимулирующее действие, активизируя метаболические процессы в клетках кожи. Восстанавливает энергетический потенциал клеток. Кожа выглядит молодой, красивой , сияет молодостью. pH 5,9. Рекомендуется: использовать под средства по типу кожи.

Состав:

колострум 5%, сахарид изомерат, экстракт сои, лецитин, аллантоин

Применение:

Концентрат распределить пальцевым душем, полностью впитать.

Производитель:

CNC (г. Филипсбург, Германия)

Действие:

Освежение, Повышение упругости, Подтяжка, Увлажнение

Время нанесения:

Универсальный

Тип кожи:

Для всех типов

Тип средства:

Концентрат

Структура белка | Изучайте науку в Scitable

Строительными блоками белков являются аминокислоты, которые представляют собой небольшие органические молекулы, состоящие из альфа (центрального) атома углерода, связанного с аминогруппой, карбоксильной группы, атома водорода и вариабельного компонента, называемого боковой цепью (см. Ниже ). Внутри белка несколько аминокислот связаны между собой пептидными связями , тем самым образуя длинную цепь. Пептидные связи образуются в результате биохимической реакции, которая извлекает молекулу воды, поскольку она соединяет аминогруппу одной аминокислоты с карбоксильной группой соседней аминокислоты.Линейная последовательность аминокислот в белке считается первичной структурой белка.

Белки состоят из набора всего из двадцати аминокислот, каждая из которых имеет уникальную боковую цепь. Боковые цепи аминокислот имеют разный химический состав. Самая большая группа аминокислот имеет неполярные боковые цепи. Некоторые другие аминокислоты имеют боковые цепи с положительным или отрицательным зарядом, в то время как другие имеют полярные, но незаряженные боковые цепи. Химический состав боковых цепей аминокислот имеет решающее значение для структуры белка, потому что эти боковые цепи могут связываться друг с другом, чтобы удерживать длину белка в определенной форме или конформации.Боковые цепи заряженных аминокислот могут образовывать ионные связи, а полярные аминокислоты способны образовывать водородные связи. Гидрофобные боковые цепи взаимодействуют друг с другом посредством слабых ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Подавляющее большинство связей, образованных этими боковыми цепями, нековалентны. Фактически, цистеины - единственные аминокислоты, способные образовывать ковалентные связи, что они и делают со своими конкретными боковыми цепями. Из-за взаимодействий боковых цепей последовательность и расположение аминокислот в конкретном белке определяют, где в этом белке происходят изгибы и складки (рис. 1).


Рис. 1: Взаимосвязь между боковыми цепями аминокислот и конформацией белка

Определяющим признаком аминокислоты является ее боковая цепь (вверху, синий кружок; внизу, все цветные кружки). Когда аминокислоты соединяются серией пептидных связей, они образуют полипептид, другое слово для обозначения белка. Затем полипептид сворачивается в определенную конформацию в зависимости от взаимодействий (пунктирные линии) между его боковыми аминокислотными цепями.


Рисунок 2: Структура белка бактериородопсина

Бактериородопсин - это мембранный белок бактерий, который действует как протонная помпа. Его форма важна для его функции. Общая структура белка включает как альфа-спирали (зеленый), так и бета-листы (красный).

Первичная структура белка - его аминокислотная последовательность - управляет складыванием и внутримолекулярным связыванием линейной аминокислотной цепи, что в конечном итоге определяет уникальную трехмерную форму белка. Водородная связь между аминогруппами и карбоксильными группами в соседних областях белковой цепи иногда вызывает определенные паттерны сворачивания. Эти стабильные паттерны сворачивания, известные как альфа-спирали и бета-листов , составляют вторичную структуру белка.Большинство белков содержат несколько спиралей и листов в дополнение к другим, менее распространенным паттернам (рис. 2). Совокупность образований и складок в одной линейной цепи аминокислот - иногда называемой полипептидом - составляет третичную структуру белка. Наконец, четвертичная структура белка относится к тем макромолекулам с множеством полипептидных цепей или субъединиц.

Окончательная форма, принятая вновь синтезированным белком, обычно является наиболее энергетически выгодной.Когда белки сворачиваются, они тестируют множество конформаций, прежде чем достичь своей окончательной формы, которая является уникальной и компактной. Сложенные белки стабилизируются тысячами нековалентных связей между аминокислотами. Кроме того, химические силы между белком и его непосредственным окружением способствуют формированию и стабильности белка. Например, белки, растворенные в цитоплазме клетки, имеют на своей поверхности гидрофильные (водолюбивые) химические группы, тогда как их гидрофобные (водоотталкивающие) элементы имеют тенденцию скрываться внутри.Напротив, белки, которые вставлены в клеточные мембраны, демонстрируют некоторые гидрофобные химические группы на своей поверхности, особенно в тех областях, где поверхность белка подвергается воздействию липидов мембран. Однако важно отметить, что полностью свернутые белки не замораживаются. Скорее, атомы в этих белках остаются способными совершать небольшие движения.

Несмотря на то, что белки считаются макромолекулами, они слишком малы, чтобы их можно было визуализировать даже в микроскоп.Итак, ученые должны использовать косвенные методы, чтобы выяснить, как они выглядят и как сложены. Наиболее распространенным методом исследования структуры белков является рентгеновская кристаллография . С помощью этого метода твердые кристаллы очищенного белка помещаются в пучок рентгеновских лучей, а диаграмма отклоненных рентгеновских лучей используется для прогнозирования положений тысяч атомов в кристалле белка.

белков и экспрессия генов | Изучайте науку в Scitable

Через призму клеточной биологии изучение экспрессии генов тесно связано с нашим пониманием белков.Начиная с ранних работ Кристиана Анфинсена в 1950-х годах, мы знаем, что последовательность аминокислот в белке определяет его окончательную трехмерную структуру. Исходя из этого, ученые неоднократно наблюдали, что структура белка определяет, где он будет действовать и что он будет делать. Нигде это не было так очевидно, как с функцией ферментов. Форма и структура белков - это важный аспект биологии экспрессии генов, который связывает наше понимание экспрессии генов с биологией клетки.Хотя в первую очередь речь идет о белковых молекулах, которые действуют на последовательности ДНК и РНК, таких как факторы транскрипции и гистоны, изучение экспрессии генов также сосредоточено на том, где в клетке модулируется экспрессия. Фактически, модуляция экспрессии генов может происходить в ядре, цитоплазме или даже на клеточной мембране из-за воздействия белков на РНК в этих клеточных субрегионах.

Как ученые изучают форму и функцию белка? Метод, называемый масс-спектрометрией, позволяет ученым определять последовательность аминокислот в белке.После того, как последовательность известна, сравнение ее аминокислотной последовательности с базами данных позволяет ученым определить, существуют ли связанные белки, функция которых уже известна. Часто аналогичные аминокислотные последовательности будут выполнять аналогичные функции в клетке. Аминокислотная последовательность также позволяет ученым предсказать заряд молекулы, ее размер и вероятную трехмерную структуру. Позже заряд и размер могут быть подтверждены экспериментально (с помощью SDS-PAGE и двухмерных гелей). Чтобы понять сложности трехмерной структуры, ученые попытаются кристаллизовать белок, чтобы подтвердить его молекулярную структуру с помощью рентгеновской кристаллографии и / или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (pNMR).

Как ученые изучают влияние белков на гены или другие белки? Хороший способ изучить функцию белка - посмотреть, что происходит в клетке, когда белок отсутствует. Для этого ученые используют модельные системы, такие как культура клеток или целые организмы, в которых они могут тестировать функцию определенных белков или генов, изменяя или мутируя их. Уровень экспрессии гена может быть рассчитан путем измерения транскрибированной мРНК (нозерн-блот), экспрессированного белка (вестерн-блот) или путем прямого окрашивания белка или мРНК, когда они все еще находятся в клетке.Новые методы изменили способ изучения экспрессии генов - микроматрицы ДНК, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) и высокопроизводительное секвенирование позволяют проводить более широкий анализ нескольких молекул одновременно и открывают возможность для новых и более широких видов вопросов. Чтобы проанализировать большие наборы данных и увидеть, как взаимодействуют сети молекул, новая дисциплина, называемая системной биологией, обеспечивает основу для этого более широкого и интегрированного понимания регуляторных сетей.

Интересно, что белки - не единственные регуляторы генов.Регуляторные молекулы имеют форму РНК и действуют на другие нуклеиновые кислоты, изменяя или разрушая их. Одним из примеров является семейство рибопереключателей, молекул рибонуклеиновой кислоты, которые образуют трехмерные структуры, которые останавливают транскрипцию или препятствуют ей при наличии надлежащего внешнего сигнала. Другой пример РНК, действующей на другие РНК, - это механизм РНК-интерференции (РНКи), при котором молекулы двухцепочечной РНК разлагают мРНК перед трансляцией, таким образом эффективно препятствуя экспрессии белка.Рассмотрение этого механизма и его последующее экспериментальное имитация было благом для тех, кто заинтересован в манипулировании функцией генов.

В конечном счете, результаты такого рода исследований имеют фундаментальное значение, от базового понимания нормальных функций клеток, таких как дифференциация, рост и деление клеток, до разработки принципиально новых подходов к лечению заболеваний. Фактически, некоторые заболевания человека могут возникать просто из-за дефекта трехмерной структуры белка.Изучая экспрессию генов и белков, легко увидеть, как мелкие изменения на молекулярном уровне имеют реверберирующий эффект.

Изображение: Библиотека биохимических алгоритмов.

Chem4Kids.com: Биохимия: Белки


Мы уже показали вам некоторую информацию об аминокислотах. Белки состоят из аминокислот. Несмотря на то, что белок может быть очень сложным, это, по сути, длинная цепь аминокислотных субъединиц, скрученная, как узел.
По мере того, как белки строятся, они начинаются как прямая цепочка аминокислот. Эта цепная структура называется первичной структурой. Иногда цепи могут связываться друг с другом двумя атомами серы (S). Эти облигации будут называться дисульфидным мостиком .
После первичной структуры идет вторичная структура. Исходная цепочка начинает скручиваться. Это как если бы вы взяли кусок веревки и скрутили один конец. Он медленно начинает сворачиваться. В аминокислотной цепи каждая из аминокислот взаимодействует с другими, и она закручивается как штопор ( альфа-спираль ) или принимает форму свернутого листа ( бета-лист ).Мы говорили об аминокислотах, которые являются гидрофобными и гидрофильными . Желание держаться подальше или быть близко к воде (H 2 O) играет определенную роль в скручивании.
Перейдем к третичной структуре белков. К настоящему времени вы, вероятно, уже поняли, что белки сильно изгибаются и скручиваются. Третий шаг в создании белка - это третичная структура. Аминокислотные цепи начинают еще больше складываться и связываться с помощью большего количества мостиков (дисульфидных мостиков).
Наконец, мы можем охватить четвертичную структуру белков. Четвертичный означает четыре. Это четвертый этап создания белка. В четвертичной структуре несколько аминокислотных цепей третичных структур складываются вместе в каплю. Вы нас правильно поняли. "Blob" - это термин, который мы используем на этом сайте. Они переплетаются, переплетаются друг с другом. Некоторые из самых известных белковых капель - это гемоглобин в эритроцитах человека и фотосистем в хлоропластах растений.

3D Proteins: The Big Picture (Видео США-NSF)


Однокомпонентные самособирающиеся белковые наночастицы, представляющие рецептор-связывающий домен и стабилизированный шип в качестве кандидатов на вакцину против SARS-CoV-2

ВВЕДЕНИЕ

Три коронавируса (CoV) вызвали массовые вспышки среди людей, включая тяжелый острый респираторный синдром CoV -1 (SARS-CoV-1), CoV с ближневосточным респираторным синдромом (MERS-CoV) и SARS-CoV-2, который является возбудителем заболевания CoV 2019 (COVID-19) ( 1 - 3 ) и привел к более чем 2.4 миллиона смертей во всем мире ( 4 ). Огромные усилия предпринимаются для разработки эффективных терапевтических и профилактических средств от SARS-CoV-2. Небольшие молекулы, которые могут блокировать рецептор хозяина, ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) и трансмембранную протеазу серин 2 (TMPRSS2) ( 5 ), которая необходима для обработки белка спайка, рассматриваются в качестве лечения в дополнение к прочие вмешательства ( 6 ). В то время как иммунология, лежащая в основе COVID-19, все еще интенсивно изучается ( 6 - 8 ), различные вакцины-кандидаты в настоящее время находятся в стадии клинической разработки ( 9 - 12 ).Инактивированные вирусные вакцины продемонстрировали устойчивые ответы нейтрализующих антител (NAb) у животных ( 13 , 14 ), тогда как вирусные векторные вакцины на основе аденовируса человека (Ad5 и Ad26) и ChAdOx1 шимпанзе оценивались на нечеловеческих приматах и ​​в испытаниях на людях ( 15 - 18 ). Как ДНК ( 19 - 21 ), так и мРНК ( 22 , 23 ) вакцины были быстро разработаны, при этом умеренные титры NAb наблюдались для мРНК вакцины в группах средних и высоких доз ( 22 ). .Рекомбинантный спайковый белок с адъювантом липидных наночастиц (НЧ), NVX-CoV2373, вызывал высокие титры NAb в испытании на людях, которые в среднем были в четыре раза выше, чем у выздоравливающих пациентов ( 24 , 25 ). Недавно сообщалось об эффективности векторной вакцины (AZD1222: 70,4%) ( 26 ) и двух вакцин с мРНК (мРНК-1273: 94,1%; BNT162b2: 95%) ( 27 , 28 ). В декабре 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) двух мРНК-вакцин.

Спайковый белок SARS-CoV-2 представляет собой тример гетеродимеров S1-S2. Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который связывается с ACE2 на клетках-хозяевах, чтобы инициировать инфекцию. Субъединица S2 состоит из гибридного пептида (FP) и областей 1 и 2 гептадных повторов (HR1 и HR2). При эндоцитозе вириона субъединица S1 отщепляется, чтобы облегчить вставку FP в мембрану клетки-хозяина, в то время как оставшаяся часть S2 повторно складывается, чтобы объединить HR1 и HR2 для слияния мембран вируса и клетки-хозяина ( 29 ).Спайковый белок содержит все эпитопы NAb и является основной мишенью для разработки вакцины против SARS-ассоциированных CoV ( 30 ). Плазма выздоравливающих использовалась для лечения пациентов с COVID-19 с тяжелыми состояниями ( 31 ), что подчеркивает важность NAb для защиты ( 32 ). Из-за умеренной консервации последовательности RBD (~ 73%) было показано, что некоторые ранее идентифицированные NAb, нацеленные на RBD SARS-CoV-1, связываются и перекрестно нейтрализуют SARS-CoV-2 ( 33 , 34 ).Используя одноклеточные технологии и SARS-CoV-2 RBD или спайк в качестве приманки, сильнодействующие NAb были изолированы от пациентов с COVID-19 ( 35 - 41 ). Одноцепочечные NAb, происходящие от верблюдовых, также были получены путем пэннинга библиотек наивных или иммунных однодоменных антител ламы (V H H) ( 42 , 43 ). Структуры спайка SARS-CoV-2 и RBD в нелигандированных ( 44 , 45 ), связанных с ACE2 ( 46 - 48 ) и связанных с антителами ( 49 - 51 ) состояниях определенные методами рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) проложили путь к рациональному дизайну вакцины.Крио-ЭМ и криоэлектронная томография (ЭТ) выявили врожденную метастабильность спайков и сосуществование спайков до / после слияния на вирионах ( 52 ). Мутация с двойным пролином ( 52 ) использовалась в большинстве конструкций растворимых шипов (S2P) и во всех вакцинах, кроме инактивированных, хотя сейчас доступна версия HexaPro с более высоким выходом и стабильностью ( 53 ). Cryo-ET также обнаружил динамический трехшарнирный стержень HR2, который облегчает проникновение вируса и уклонение от иммунитета ( 54 - 56 ).

В этом исследовании мы разработали и оптимизировали антигены SARS-CoV-2 для поливалентного отображения на самособирающихся белковых NP (SApNP) ( 57 - 59 ), включая 24-мерный ферритин (FR) и два 60 -меры (E2p и I3-01v9), содержащие внутренний слой блокирующих доменов (LD) и кластер «Т-клеточных» эпитопов ( 60 ). Чтобы облегчить очистку вакцин без меток, мы разработали иммуноаффинную колонку на основе антитела CR3022, которое связывается с обоими RBD SARS-CoV-1/2 ( 34 , 50 ).Сначала мы разработали конструкцию тримера RBD, имитирующую конформацию шипа RBD-up. RBD SARS-CoV-1/2 были прикреплены к SApNP с помощью системы SpyTag / SpyCatcher ( 61 ), что обеспечило надежную стратегию разработки NP-вакцин на основе RBD. Затем мы исследовали метастабильность спайка, сравнивая два нерасщепленных антигена спайка, S2P (K986P / V987P) и S2G (K986G / V987G). Спайк SARS-CoV-2 S2G проявлял ненормальное поведение, предполагая, что неидентифицированная грань спайка может способствовать конформационным изменениям и блокировать доступ антител к RBD.Спайк с делецией HR2, S2GΔHR2, продуцировал тримеры высокой чистоты, предполагая, что стебель HR2 может быть триггером метастабильности спайка, что согласуется с недавними открытиями ( 54 - 56 ). Затем мы продемонстрировали S2GΔHR2 на трех SApNP путем слияния генов, в результате чего были получены спайковые SApNP с высоким выходом, чистотой и антигенностью. При иммунизации мышей спайковый белок S2P вызывал самый низкий уровень ответа NAb. Напротив, тример RBD с каркасом регистрировал в два-три раза более высокие титры NAb, с еще одним пятикратным увеличением титра NAb, достигнутым за счет поливалентного отображения на FR.S2GΔHR2 вызывал до семи раз более высокие титры NAb, в то время как большие многослойные S2GΔHR2 E2p и I3-01 SApNP вызывали до 10 раз более высокие титры NAb, чем S2P. Дальнейший анализ показал, что SApNP I3-01v9, представляющий S2GΔHR2, может вызывать сильный ответ Т-хелпера 1 (T H 1) и другие типы ответов Т-клеток, необходимые для защитного клеточного иммунитета. Таким образом, наше исследование идентифицирует стебель HR2 как основной источник метастабильности спайков, подтверждает дизайн спайков с удаленным HR2 и предоставляет набор вирусоподобных частиц (VLP) на основе RBD и спайков в качестве эффективных кандидатов в белковые вакцины против SARS-CoV. -2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рациональная конструкция каркасных тримеров RBD и представляющих RBD SApNPs

Связывание RBD с рецептором ACE2 инициирует процесс слияния мембран ( 5 ). Кристаллическая структура комплекса SARS-CoV-2 RBD / ACE2 выявила атомные детали распознавания рецептора ( 62 ). SARS-CoV-2 RBD использовался в качестве приманки для выделения моноклональных антител (mAb) из образцов пациентов ( 35 - 41 ). Для SARS-CoV-1 и MERS-CoV вакцины на основе RBD индуцировали мощные NAb, которые эффективно блокируют проникновение вируса ( 30 ).Следовательно, RBD представляет собой главную мишень для гуморальных реакций после инфекции и может использоваться для разработки эпитоп-ориентированных вакцин.

Мы сначала предположили, что RBD, прикрепленный к тримерному каркасу, может имитировать конформацию RBD-up spike и вызывать NAb, которые блокируют связывание ACE2. Чтобы проверить эту возможность, мы разработали гибридную конструкцию, содержащую SARS-CoV-1/2 RBD, короткий 5-аминокислотный линкер G 4 S (с сайтом рестрикции из 2-х аминокислот) и тримерный вирусный капсидный белок, SHP [Банк данных белков (PDB): 1TD0] (Рис.1А). Структурное моделирование показало, что три связанных RBD образуют треугольник 92 Å (измерено на L492), что на 14 и 18 Å шире, чем шип SARS-CoV-1 «два-RBD-up» (PDB: 6CRX, измеренный на L478). ) ( 63 ) и спайк «all-RBD-up» MERS-CoV (PDB: 5X59, измеренный для L506) ( 64 ), соответственно, обеспечивая доступ NAb к каждому RBD. Затем мы разработали колонку для иммуноаффинной хроматографии (IAC), чтобы облегчить очистку без меток. Ранее колонки IAC, полученные на основе NAb, использовались для очистки тримеров / НЧ Env ВИЧ-1 ( 58 , 59 , 65 , 66 ), ядер / НЧ E2 вируса гепатита С (HCV) ( 57 ) и тримеры / НЧ гликопротеина (GP) вируса Эбола (EBOV) ( 60 ).Тиан и др. ( 34 ) сообщил, что SARS-CoV-1 NAb, CR3022, может связывать SARS-CoV-2 RBD. Структура SARS-CoV-2 RBD / CR3022 выявила консервативный криптический эпитоп, который является общим для двух SARS-CoV, что позволяет предположить, что временные дыхательные движения спайкового белка позволили CR3022 связываться с RBD ( 50 ). Здесь мы рассмотрели полезность CR3022 в столбцах IAC. Конструкции SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-1TD0 временно экспрессировали в клетках ExpiCHO объемом 100 мл и очищали на колонке CR3022 перед эксклюзионной хроматографией (SEC) с использованием колонки Superdex 200 10/300 GL.В то время как конструкция SARS-CoV-1 RBD показывала пики агрегатов (~ 8,6 мл) и тримеров (~ 12,7 мл) в профиле SEC, конструкция SARS-CoV-2 RBD давала один чистый пик тримеров при ~ 12,8 мл ( Рис. 1Б). При электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) полоса мономера ~ 37 кДа и полоса тримеров ~ 100 кДа наблюдались в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, соответственно (рис. S1A). Антигенность была оценена для двух каркасных тримеров RBD в иммуноферментном анализе (ELISA) после очистки CR3022 / SEC (рис.1С). Специфические для RBD NAb, нацеленные на SARS-CoV-1 [CR3022 ( 67 ), m396 ( 68 ), 80R ( 69 ) и S230 ( 70 )] и SARS-CoV-2 [B38 ( 38 ), CB6 ( 37 ), S309 от выжившего после SARS ( 33 ) и P2B-2F6 ( 36 )] были протестированы в ELISA. В целом, аналогичные значения полумаксимальной эффективной концентрации (EC 50 ) наблюдались для двух тримеров RBD, связывающихся с их соответствующими NAb (фиг. 1C). Тример SARS-CoV-1 RBD показал большее сродство к CR3022, чем его аналог SARS-CoV-2, с показателем 1.3-кратная разница в значениях EC 50 , что согласуется с предыдущими результатами ( 34 , 50 ). Из NAb SARS-CoV-2, B38 дал такое же значение EC 50 , что и CR3022, который может связывать, но не нейтрализовать SARS-CoV-2. Кинетику связывания антител измеряли с помощью интерферометрии биослоя (BLI) (рис. 1, B и D). В целом, все протестированные mAb показали высокую скорость включения, но с видимыми различиями в скорости их отклонения. B38 показал более быстрое снижение скорости, чем другие NAb SARS-CoV-2, в то время как CR3022, mAb, используемое для очистки белков RBD SARS-CoV-1/2, продемонстрировало сопоставимый кинетический профиль.

Рис. 1 Рациональная конструкция вакцин на основе SARS-CoV-1/2 RBD.

( A ) Структурная модель RBD-5GS-1TD0 в расширенном состоянии RBD-up (вид сверху и вид сбоку). 1TD0 - это тримеризационный каркас вирусного происхождения. ( B ) Профили SEC тримеров RBD, каркасных для SARS-CoV-1/2, после экспрессии ExpiCHO и очистки CR3022. УФ 280 , поглощение ультрафиолета при 280 нм. ( C ) Связывание с помощью ELISA тримеров RBD на каркасах SARS-CoV-1/2 с панелью mAb.Значения EC 50 (мкг / мл) помечены. Ab, антитело. ( D ) Связывание октета тримерного RBD на основе SARS-CoV-2 с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 950 до 29,5 нМ путем двукратных разведений. ( E ) Схема конъюгирования RBD с 24-мерным FR SApNP с использованием системы SpyTag / SpyCatcher (SPY). ( F ) Профили SEC SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-SPY-5GS-FR, полученных в ExpiCHO путем коэкспрессии (черная линия) и смеси супернатанта (красная линия).( G ) Связывание с помощью ELISA SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-FR с панелью mAb. Значения EC 50 (мкг / мл) помечены. ( H ) Октетное связывание SApNP SARS-CoV-2 RBD-FR с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 37 до 1,1 нМ путем двукратных разведений. ( I ) ЭМ-изображения SARS-CoV-1 RBD-10GS-FR (слияние генов) и RBD-5GS-SPY-5GS-FR (коэкспрессия). ( J ) ЭМ-изображения SARS-CoV-2 RBD-5GS-SPY-5GS-FR, полученные путем совместной экспрессии и смеси супернатанта.( K ) Схема сопряжения RBD с 60-мерным многослойным I3-01v9 SApNP с использованием системы SPY. Изображены блокирующие домены (LD) и Т-хелперные эпитопы в многослойной SApNP. ( L и M ) Профили SEC и ЭМ изображения SApNP SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-SPY-5GS-I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P), полученные с помощью смеси супернатантов . Профили SEC каркасных тримеров RBD в (B) и SPY-связанных SApNP RBD в (F) и (L) были получены из колонки Superdex 200 10/300 GL и колонки Superose 6 10/300 GL соответственно.

Затем мы выдвинули гипотезу, что система SpyTag / SpyCatcher (названная SPY) может быть использована для конъюгирования RBD с SApNP для создания поливалентных вакцин RBD, способных вызывать более сильный ответ NAb (рис. 1E). SpyTag из 13 аминокислот спонтанно реагирует с белком SpyCatcher с образованием необратимой изопептидной связи ( 61 ). Система SPY успешно использовалась для прикрепления антигенов к VLP ( 71 ). Здесь SpyTag был слит с С-концом RBD, тогда как SpyCatcher был слит с N-концом субъединицы SApNP, оба с 5-аминокислотным линкером G 4 S.Эта конструкция была впервые испытана для 24-мерной FR. Здесь мы сравнили две стратегии продукции, коэкспрессию RBD-5GS-SpyTag и SpyCatcher-5GS-FR по сравнению со смесью супернатанта после отдельной экспрессии, с последующей очисткой на колонке CR3022. Белок, полученный в результате временной трансфекции в 50-мл клетки ExpiCHO, анализировали с помощью SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 1F). Обе стратегии продуцирования дали пик (12 мл), соответствующий SApNP. В то время как конструкция SARS-CoV-2 превзошла своего аналога SARS-CoV-1 по выходу частиц (0.От 6 до 1,0 мг по сравнению с 0,3 до 0,5 мг после CR3022 / SEC), смесь супернатантов оказалась лучше, чем совместная экспрессия по выходу в обоих случаях. Таким образом, результаты показывают, что обе стратегии могут быть использованы для получения RBD SApNP в клетках яичника китайского хомячка (CHO) в промышленных условиях, поскольку эта экспрессионная система млекопитающих широко используется для производства терапевтических гликопротеинов в условиях надлежащей производственной практики (GMP) ( 72 , 73 ). Антигенность оценивали для SEC-очищенных SApNP RBD-5GS-SPY-5GS-FR.В ELISA RBD SApNP показали немного улучшенное связывание mAb по сравнению с тримерами RBD, на что указывают значения EC 50 (фиг. 1G). В BLI наблюдалось более выраженное влияние мультивалентного дисплея на антигенность, показывая заметно увеличенные сигналы связывания и плато диссоциации (рис. 1, C и H). Структурная целостность различных RBD SApNP была проанализирована с помощью отрицательной окраски EM (nsEM) (рис. 1, I и J). Для SARS-CoV-1 генетически слитая конструкция RBD-10GS-FR продуцировала очень мало, хотя и очень чистых, SApNP (рис.1И, слева). Напротив, конструкция RBD-5GS-SPY-5GS-FR давала высокий выход SApNPs с видимыми украшениями поверхности (рис. 1I, справа). Для SARS-CoV-2 очищенные SApNP RBD-5GS-SPY-5GS-FR, независимо от производственной стратегии, показали морфологию хорошо сформированных частиц (рис. 1J). Ранее мы генетически слили небольшой белок LD и Т-клеточный эпитоп с каждой субъединицей 60-меров E2p и I3-01v9, в результате чего получили «многослойные» SApNPs ( 60 ). PADRE, 13-аминокислотный pan-DR эпитоп, который активирует CD4 + Т-клетки ( 74 ), был использован для стимулирования развития В-клеток в направлении NAb.Здесь два лучших дизайна, E2p-LD4-PADRE (или E2p-L4P) и I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P), были протестированы на их способность отображать SARS-CoV-1/2. RBDs. Следуя стратегии, установленной для FR, RBD SARS-CoV-1/2 были присоединены к I3-01v9-L7P SApNP с помощью системы SPY (рис. 1K). Несмотря на скромный выход клеток ExpiCHO (рис. 1L), на изображениях ЭМ наблюдались большие и чистые частицы (рис. 1M). Однако некоторые примеси были отмечены для представляющих RBD SApNP E2p-L4P (рис. S1D). Тем не менее, мы проиллюстрировали полезность системы SPY для быстрой разработки вакцин против SARS-CoV-1/2 RBD на основе трех различных платформ SApNP.

Недавно RBD отображались на различных SApNP, использующих систему SPY, как кандидаты на вакцины MERS-CoV и SARS-CoV-2 ( 75 , 76 ). Walls et al. ( 77 ) также сообщил о кандидате вакцины против SARS-CoV-2 RBD на основе двухкомпонентной платформы NP, для которой требуется компонент «соединитель» для облегчения сборки NP ( 78 ), что, вероятно, приводит к неоптимальной стабильности. Кроме того, все эти вакцины-кандидаты требуют сложного производственного процесса, включающего две системы экспрессии, отдельные стадии очистки и стадию сборки in vitro перед окончательной очисткой.Напротив, наши SPY-связанные RBD SApNP являются однокомпонентными по своей природе и могут быть произведены в клетках CHO с простой схемой очистки, предлагая уникальные преимущества в стабильности и технологичности.

Рациональный дизайн спайка перед слиянием за счет минимизации метастабильности

В дополнение к RBD спайки SARS-CoV-1/2 содержат другие эпитопы NAb ( 30 ), которые все представлены в тримерном контексте (рис. 2A) . Мутация двойного пролина (2P) между HR1 и центральной спиралью (CH) была использована для стабилизации спайков MERS-CoV ( 79 ) и SARS-CoV-1 ( 63 ).Похожая мутация 2P (K986P / V987P) была введена в спайк SARS-CoV-2 (названный S2P), который использовался для выделения и характеристики NAb ( 33 , 35 , 40 , 42 - 45 , 49 ) и является антигеном почти во всех вакцинах-кандидатах, находящихся в клинической разработке ( 11 , 12 ). Однако недавнее исследование крио-ЭМ выявило неожиданную упаковку S1 в шипе S2P, расположенную на ~ 12 Å наружу по сравнению с полноразмерным нативным шипом, а также более упорядоченную проксимальную область FP (FPPR) в S2 ( 52 ).Были созданы новые конструкции для контроля конформации шипа ( 80 ) или для его дальнейшей стабилизации с помощью большего количества пролинов (HexaPro) ( 53 ). Недавние исследования крио-ЭМ и крио-ЭТ показали, что шипы SARS-CoV-2 могут принимать различные ориентации на нативных вирионах из-за очень гибкой ножки HR2 ( 54 - 56 ). Ранее мы определили изгиб HR1 как причину метастабильности Env ВИЧ-1 ( 58 , 81 ) и исследовали роль эквивалентного изгиба HR1 и ножки HR2 в метастабильности EBOV GP ( 60 ).Такое понимание метастабильности оказалось критически важным для разработки стабильных тримеров и тример-презентирующих вакцин SApNP для обоих вирусов ( 58 - 60 , 81 ). Поэтому крайне важно изучить причину (ы) метастабильности спайков, чтобы облегчить разработку рациональной вакцины против SARS-CoV-2.

Рис. 2 Рациональная конструкция спайковых антигенов SARS-CoV-2.

( A ) Структурная модель префузионного S-шипа, связанного с С-концевым доменом тримеризации (1TD0) с помощью линкера 5GS на прозрачной молекулярной поверхности.Приблизительное положение неструктурированной ножки HR2 или, в данном случае, 5-аминокислотного (а.о.) линкера G 4 S выделено пунктирной линией. ( B ) Профили SEC шипов SARS-CoV-1 (вверху) и SARS-CoV-2 (внизу). Панели слева направо: S2P ECTO -5GS-1TD0, очищенный на никелевых колонках и CR3022 (1 и 2), S2G ECTO -5GS-1TD0 на никелевых колонках и CR3022 (3 и 4) и S2GΔHR2-5GS-1TD0 на колонке CR3022 (5). Все спайковые конструкции, протестированные в (B), содержат C-концевую метку His 6 для облегчения очистки колонки с никелем.Результаты трех отдельных производственных циклов показаны для SARS-CoV-2 S2G ECTO -5GS-1TD0. ( C ) Схематическое изображение полноразмерного шипа SARS-CoV-2 на поверхности вирусной мембраны в присутствии ACE2 хозяина и области HR2 из соседнего шипа (слева) и выравнивание последовательностей SARS-CoV-1 / 2 области HR1 и HR2 (справа, сверху и снизу). Сегменты HR1 и HR2, которые образуют пучок из шести спиралей в состоянии после слияния, выделены зеленым и коричневым оттенком соответственно.( D ) Слева: профили SEC S2GΔHR2-5GS-1TD0, показывающие результаты четырех отдельных производственных циклов. Справа: анализ BN-PAGE S2P ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0. Фракции SEC (от 12,5 до 14,0) показаны для S2GΔHR2-5GS-1TD0 на геле. Профили SEC в (B) и (D) были получены из колонки Superose 6 10/300 GL. ( E ) Связывание с помощью ELISA двух шипов SARS-CoV-2 (S2P ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0) с пятью mAb. Значения EC 50 (мкг / мл) помечены.( F ) Связывание октетов двух шипов SARS-CoV-2 (S2P ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0) с пятью mAb. Сенсограммы получали на приборе Octet RED96 при шести концентрациях антигена от 150 до 4,7 нМ путем двукратных разведений. Спайковые конструкции, испытанные в (D) - (F), не содержат C-концевую метку His 6 .

Сначала мы создали конструкции нерасщепленного спайкового эктодомена (S ECTO ) для SARS-CoV-1/2, обе содержащие мутацию 2P (K968P / V969P и K986P / V987P, соответственно), 5-аминокислотную G 4 S-линкер, мотив тримеризации (PDB: 1TD0) и C-концевой His 6 тег.Две конструкции временно экспрессировали в 50-мл клетках ExpiCHO с последующей очисткой либо на никелевой колонке, либо на колонке CR3022. Белок S2P ECTO -5GS-1TD0-His 6 охарактеризовали с помощью SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 2B, панели 1 и 2). После никелевой колонки обе конструкции S2P ECTO показали пик тримеров (~ 12 мл) с левым и правым плечом, указывающими на агрегат и разновидности димера / мономера, соответственно. Очистка CR3022 привела к устойчивому пику тримеров и снижению количества димеров / мономеров.Затем мы сравнили пару конструкций S ECTO для SARS-CoV-1/2, обе из которых содержат мутацию двойного глицина (2G), K968G / V969G и K986G / V987G, соответственно. Мутация 2G мало повлияла на спайк SARS-CoV-1, но вызвала аномальные профили SEC и не показала выхода для спайка SARS-CoV-2 после очистки на никелевых колонках и CR3022 соответственно (рис. 2B, панели 3 и 4. ). Наконец, мы протестировали пару конструкций S2G без стебля HR2 (E1150-Q1208), названных S2GΔHR2. Удаление стебля HR2 восстановило пик тримера SARS-CoV-2 и уменьшило агрегаты для обоих SARS-CoV-1/2, как показано профилями SEC после очистки CR3022 (рис.2Б, панель 5). Поскольку трехшарнирный стержень HR2 может генерировать различные ориентации шипов на нативных вирионах ( 54 - 56 ), а ядро ​​слияния образовано HR1 и HR2, мы предположили, что HR2 может быть ключевым детерминантом SARS-CoV- 2 метастабильности спайка (рис. 2С, слева). Вероятно, что взаимодействия между HR1 и HR2 двух соседних шипов могут способствовать переходу от пре- до пост-слияния в дополнение к связыванию ACE2 и диссоциации S1. Учитывая значительную разницу в последовательностях HR1 (всего 9 аминокислот) по сравнению с SARS-CoV-1 (рис.2C, справа), мы стремились изучить вклад HR1 в метастабильность спайков SARS-CoV-2 с двумя конструкциями спайков с заменой HR1 (HR1 S ). В то время как замена HR1 оказалась неэффективной, удаление ножки HR2 снова восстановило пик тримера, что указывает на более важную роль HR2 (рис. S2, от A до C). Следовательно, S2GΔHR2, по-видимому, является общей схемой шипа для SARS-CoV-1/2 и, возможно, других CoV. Четыре отдельных прогона продукции SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-1TD0 в 300-мл клетках ExpiCHO привели к почти идентичным профилям SEC с выходами тримеров 0.От 8 до 1,0 мг (рис. 2D, слева). Соответственно, синий нативный PAGE (BN-PAGE) показал высокую чистоту тримеров во всех фракциях SEC (фиг. 2D, справа). Антигенность оценивалась для шиповых белков SARS-CoV-2 S2P ECTO и S2GΔHR2, очищенных с помощью CR3022 / SEC. В ELISA спайк S2GΔHR2 показал немного более высокое сродство к пяти репрезентативным mAb, чем спайк S2P ECTO (фиг. 2E). При тестировании с тремя недавно идентифицированными человеческими NAb, C105 ( 49 ) и CC12.1 / CC12.3 ( 41 ), два шипа дали аналогичные значения EC 50 (рис.S2D). В BLI спайк S2GΔHR2 показал более высокие сигналы связывания, чем спайк S2P ECTO при наивысшей концентрации, демонстрируя сходную кинетику связывания (фиг. 2F). Использование NAb P2B-2F6 ( 36 ) для спайковой очистки привело к более высокому выходу тримеров с такой же чистотой, что и на колонке CR3022 по фракциям SEC (рис. S2E). Термостабильность оценивалась методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для спайков SARS-CoV-2 S2P , ECTO и S2GΔHR2, очищенных с помощью CR3022 / SEC (рис.S2F). После замены 2P на 2G и делеции HR2 наблюдалось небольшое увеличение средней точки термической денатурации ( T m ) (46,8 ° C по сравнению с 47,6 ° C) с заметно более высокой температурой начала ( T на ), 35,2 ° C против 40,0 ° C и более узкую полуширину пика ( Δ T 1/2 ), 4,7 ° C против 3,9 ° C. Вместе мы продемонстрировали, что ножка HR2 является основным источником метастабильности спайка, а S2GΔHR2 представляет собой альтернативный дизайн спайка по сравнению с S2P, хотя для достижения большей термостабильности может потребоваться больше стабилизирующих мутаций.

Рациональная конструкция однокомпонентных самособирающихся НЧ шипов

Хотя было возможно конъюгировать тримерные шипы SARS-CoV-2 с SApNP с помощью системы SPY ( 82 ), случайное необратимое связывание, вероятно, приведет к нерегулярный дисплей с незанятыми, но пространственно закрытыми точками крепления на поверхности. Система SPY, возможно, больше подходит для небольших индивидуальных антигенов (например, RBD). Используя подход слияния генов, мы ранее разработали однокомпонентные SApNPs, отображающие стабилизированные тримеры Env ВИЧ-1 ( 58 , 59 ) и оптимизированные ядра E2 HCV ( 57 ).Недавно мы модернизировали E2p и I3-01v9 60-mers, чтобы включить внутренний слой LDs для стабилизации нековалентно сформированной оболочки NP в дополнение к кластеру эпитопов Т-клеток ( 60 ). Эта многослойная конструкция может иметь важное значение для стабильности получаемых вакцин SApNP, когда они используются для отображения больших сложных вирусных антигенов, таких как спайк SARS-CoV-2.

Нативные вирионы SARS-CoV-2 имеют спайки как до, так и после слияния ( 52 , 54 , 55 ) (рис.3A, вверху), в то время как наша стратегия вакцины направлена ​​на разработку однокомпонентных SApNP, каждый из которых представляет 8 или 20 стабильных префузионных пиков S2GΔHR2 в иммунной системе (фиг. 3A, внизу). Как продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях ( 58 , 59 ), для соединения тримеров с поверхностью SApNP могут потребоваться линкеры разной длины, поскольку расстояние между N-концами субъединиц NP вокруг каждой оси третьего порядка варьируется: FR (20 Å), E2p (9 Å) и I3-01v9 (50,5 Å). На основе этого рассмотрения мы отобразили спайк S2GΔHR2 на FR с 5-аминокислотным линкером G 4 S, на E2p с 5-аминокислотным линкером G 4 S и на I3-01v9 с 10 –Аминокислота (G 4 S) 2 линкер, приводящий к SApNP с диаметром 47.9, 55,9 и 59,3 нм соответственно (рис. 3Б). Многослойные E2p-L4P и I3-01v9-L7P ( 60 ), которые были утверждены для представления RBD (рис. 1, K – L и рис. S1D), использовались здесь как носители NP шипа S2GΔHR2. Вместе три конструкции S2GΔHR2 SApNP временно экспрессировали в 400-мл клетках ExpiCHO с последующей очисткой CR3022 и SEC на колонке Superose 6 10/300 GL (фиг. 3C). Три производственных цикла для каждой из трех конструкций сгенерировали очень согласованные профили SEC, несмотря на изменение низкомолекулярных примесей, наблюдаемых для FR и E2p-L4P.После очистки CR3022 и SEC мы получили от 0,3 до 0,4, от 0,5 до 1,0 и от 0,8 до 1,2 мг белка для S2GΔHR2-5GS-FR, S2GΔHR2-5GS-E2p-L4P и S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-L7P, соответственно. . В целом, полученный из I3-01v9 SApNP S2GΔHR2 оказался наиболее эффективным с точки зрения выхода частиц, чистоты и стабильности. Структурная целостность была проанализирована с помощью nsEM, который показал хорошо сформированные частицы размером от 45 до 65 нм с узнаваемыми выступами на поверхности (рис. 3D). Различная форма этих профилей может соответствовать шипам S2GΔHR2 с «открытыми» RBD, в отличие от множества «закрытых» тримеров HIV-1 и EBOV на поверхности SApNP ( 58 - 60 ).Эта открытая конформация может способствовать индукции сильного RBD-специфического ответа NAb in vivo. Антигенность SApNP S2GΔHR2 оценивали с использованием той же панели mAb. В ELISA три SApNP показали немного улучшенное связывание с некоторыми, но не со всеми mAb по сравнению с индивидуальным спайком (фиг. 3E). В BLI мы наблюдали четкую корреляцию между пиковым сигналом связывания mAb и валентностью антигена с E2p / I3-01v9> FR> spike (фиг. 3F). Многовалентный дисплей на двух 60-мерах существенно увеличивал связывание mAb по сравнению с FR 24-мером.В предыдущих исследованиях мы наблюдали аналогичную корреляцию для тримера Env ВИЧ-1 и ядра E2 HCV по сравнению с их SApNP ( 57 , 58 ). Таким образом, эти SApNP размером с VLP с 8 или 20 шипами на поверхности представляют собой многообещающие вакцины-кандидаты для оценки in vivo.

Рис. 3. Рациональная конструкция вакцины против NP, представляющей спайк SARS-CoV-2.

( A ) Схематическое изображение вириона SARS-CoV-2 (вверху) и вакцины SApNP, представляющей спайк (внизу). Для вириона SARS-CoV-2 показаны вирусный геном до / после слияния, нуклеокапсид и РНК, а для вакцины - стабилизированный спайк и многослойная композиция SApNP.( B ) Цветные поверхностные модели носителей SApNP (вверху) и вакцин SApNP, представляющих спайк (внизу). Используемые здесь три носителя SApNP - это 24-мерные FR и многослойные E2p и 60-мерные I3-01v9 (слой LD и кластер PADRE не показаны). Размер частиц указывается диаметром (в нанометрах). ( C ) Профили SEC трех SApNP, представляющих спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2, слева направо, S2GΔHR2-5GS-FR, S2GΔHR2-5GS-E2p-LD4-PADRE (или E2p-L4P) и S2GΔHR2- 10GS-I3-01v9-LD7-PADRE (или I3-01v9-L7P).Профили SEC были получены из колонки Superose 6 10/300 GL, каждая из которых показывает результаты трех отдельных производственных циклов. ( D ) ЭМ-изображения трех SApNP SARS-CoV-2 S2GΔHR2. ( E ) Связывание с помощью ELISA трех SApNP SARS-CoV-2 S2GΔHR2 с пятью mAb. Значения EC 50 (мкг / мл) помечены. ( F ) Антигенные профили спайка SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и трех SApNP против пяти mAb. Сенсограммы были получены с Octet RED96 с использованием шести концентраций антигена (от 150 до 4.6 нМ для шипа, от 9 до 0,27 нМ для FR SApNP и от 3,5 до 0,1 нМ для E2p и I3-01v9 SApNP, соответственно, все путем двукратных разведений) и биосенсоров AHQ, как показано на рис. S3B. Перечислены пиковые сигналы связывания (в нанометрах) при наивысшей концентрации. Цветовая кодировка указывает уровень сигнала, измеренный октетом (от зеленого к красному: от низкого к высокому).

SARS-CoV-1/2 вакцина-индуцированный ответ связывающих антител

Выбранные конструкции вакцины SARS-CoV-1/2 RBD и спайков оценивались на мышах BALB / c (рис.4А). Мы приняли аналогичный протокол иммунизации, чтобы он соответствовал нашим предыдущим исследованиям SApNPs ВИЧ-1, HCV и EBOV ( 57 , 58 , 60 ). Вкратце, группы из пяти мышей иммунизировали четыре раза с 3-недельными интервалами. Все антигены (50 мкг на дозу) были приготовлены с AddaVax, адъювантом эмульсии масло-в-воде, за исключением I3-01v9, который был смешан с фосфатом алюминия ( 83 ). Сначала мы проанализировали ответы связывающих антител (bAb), измеренные титрами EC 50 , в двух группах вакцины SARS-CoV-2 RBD (рис.4B и рис. S4). Связанный со SPY RBD SApNP (RBD-5GS-SPY-5GS-FR) вызывал значительно более высокие титры bAb, чем тример RBD с каркасом (RBD-5GS-1TD0) на 2-й неделе (w2) и w5, независимо от покрывающего антигена, и дало значительное значение P на w8 при нанесении покрытия на RBD. По сравнению со спайком S2P ECTO (S2P ECTO -5GS-1TD0) RBD SApNP вызывал значительно более высокие титры bAb против RBD на w2, w5 и w8 (рис. 4B, справа), демонстрируя сильный эпитопный эффект. эффект фокусировки.Сыворотка мышей связала спайк SARS-CoV-1 с более низкими титрами EC 50 , чем спайк SARS-CoV-2, но с аналогичными паттернами (рис. S4A). Затем мы проанализировали ответы bAb, вызванные спайками SARS-CoV-2 S2P ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0, а также трех SApNPs, каждый из которых имеет 8 или 20 спайков S2GΔHR2 (рис. 4C и рис. S5). . Спайк S2GΔHR2 показал в два-три раза более высокие средние титры EC 50 , чем спайк S2P ECTO , независимо от покрывающего антигена (примечательно, что для облегчения справедливого сравнения сыворотки мышей из этих двух групп были протестированы против их соответствующего спайка. антигены).Три SApNP демонстрировали разные временные структуры в зависимости от покрывающего антигена. Что касается спайк-специфического ответа, группа I3-01v9 зарегистрировала устойчивое увеличение среднего титра EC 50 с течением времени, показывая самые высокие титры bAb на w2 и w8 и значительно превосходя группу S2P ECTO во все моменты времени. Группа I3-01v9 также показала более высокие титры EC 50 , чем группа S2GΔHR2, хотя и не со значительными значениями P . Группа FR SApNP показала аналогичную временную картину с более низкими титрами EC 50 , которые все еще были значительно выше, чем группа S2P ECTO .Среди трех SApNP, E2p показал самый низкий средний титр EC 50 при w2 и достиг наивысшего значения при w5, который затем немного снизился на w8. Что касается ответа, специфичного для RBD, пять групп продемонстрировали четкий рейтинг, основанный на их средних титрах EC 50 , которые оставались неизменными по временным точкам. На w2 I3-01v9 показал средний титр EC 50 , равный 175, тогда как все другие вакцины на основе спайков вызвали слабый RBD-специфический ответ bAb. На w5 и w8, S2GΔHR2 вызывал более высокие титры bAb (в среднем в два раза), чем S2P ECTO , в то время как все три SApNP превосходили индивидуальный спайк S2GΔHR2 с рейтингом средних титров EC 50 , который коррелировал с их размером (FR < E2p ECTO (S2P ECTO -5GS-1TD0), скаффолдным тримером RBD (RBD-5GS-1TD0) и SPY-связанным RBD SApNP. (RBD-5GS-SPY-5GS-FR) (Рис. 4D и Рис. S6). На основании средних титров EC 50 , пик SARS-CoV-1 S2P ECTO , по-видимому, вызывал более устойчивый ответ bAb, чем пик SARS-CoV-2 S2GΔHR2, тогда как SARS-CoV-1 RBD SApNP был менее выгоден, чем его аналог SARS-CoV-2.Реактивность сыворотки с пиком SARS-CoV-2 S2P ECTO наблюдалась для всех трех групп вакцины против SARS-CoV-1 (рис. S6A). Таким образом, RBD SApNP могут вызывать более высокие титры RBD-специфических bAb, чем скаффолдный тример RBD и спайк S2P ECTO , хотя и на разных уровнях для двух SARS-CoV. Спайк S2GΔHR2 более иммуногенен, чем спайк S2P ECTO , показывая, в среднем, в два раза более высокие титры bAb. S2GΔHR2-презентирующие E2p и I3-01v9 SApNP являются лучшими показателями среди всех спайковых вакцин, что согласуется с нашими предыдущими результатами для этих двух крупных SApNP ( 57 , 58 , 60 ).

Фиг.4. Вакцинация против SARS-CoV-1/2 отвечает на bAb у мышей BALB / c.

( A ) Схематическое изображение протокола иммунизации мышей. ( B ) Ответы bAb, индуцированные вакциной SARS-CoV-2 RBD и RBD-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-фолдон (слева) и RBD (справа). ( C ) Спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и ответы bAb, индуцированные вакциной S2GΔHR2-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-2 S2GΔHR2-5GS-фолдон (вверху) и RBD (внизу). В (B) и (C) для сравнения включена группа SARS-CoV-2 S2P ECTO -5GS-1TD0 с S2P ECTO -5GS-фолдоном, используемым в качестве покрывающего антигена.( D ) Ответы bAb, индуцированные вакциной SARS-CoV-1 RBD и RBD-SApNP. Покрывающие антигены: SARS-CoV-1 S2P ECTO -5GS-фолдон (слева) и RBD (справа). В (D) для сравнения включена группа SARS-CoV-1 S2P ECTO -5GS-1TD0, при этом S2P ECTO -5GS-фолдон используется в качестве покрывающего антигена. В (B) - (D) нанесены титры EC 50 , полученные из ELISA связывания плазмы мыши с покрывающими антигенами, со средними значениями EC 50 , отмеченными на графиках.Значения P были определены с помощью непарного теста t в GraphPad Prism 8.4.3, где (*) указывает уровень статистической значимости. Подробные данные ELISA показаны на фиг. От S4 до S6.

Вакцина SARS-CoV-1/2 ответ на NAb

Одной из основных целей разработки вакцины COVID-19 является создание мощного NAb-ответа, который может защитить от инфекции SARS-CoV-2. Анализы нейтрализации псевдочастиц (SARS-CoV-1/2-pp) ( 84 ) использовали для оценки сывороточных ответов NAb, вызванных различными вакцинами.Сначала мы проанализировали ответы NAb, измеренные по титрам 50% -ного ингибирующего разведения (ID 50 ), в двух группах вакцины против SARS-CoV-2 RBD (фиг. 5A и фиг. S7). Связанный со SPY RBD SApNP вызывал ответ NAb против аутологичного SARS-CoV-2 еще на w2, хотя и с низкими титрами, и сохранял свое преимущество на w5 и w8, что позволяет предположить, что эти вакцины RBD SApNP могут вызывать быстрый ответ NAb. Группа тримеров RBD с каркасом показала более высокие средние титры ID 50 , чем группа спайков S2P ECTO как на w5, так и на w8.Несколько иную картину наблюдали в анализе SARS-CoV-1-pp. На w2 ни одна вакцинированная группа не показала детектируемого гетерологичного ответа на NAb. На w5 и w8 спайк S2P ECTO вызывал более мощный ответ NAb против SARS-CoV-1, чем тример RBD с каркасом, что позволяет предположить, что эпитопы не-RBD на спайке могут вносить вклад в перекрестную нейтрализацию. Затем мы проанализировали ответы NAb, вызванные пятью вакцинами на основе спайков (фиг. 5B и фиг. S8). Что касается аутологичной нейтрализации, ни одна вакцина на основе спайков не вызвала какой-либо ответ NAb, который блокирует SARS-CoV-2-pps после одной дозы, но постоянный образец нейтрализации сыворотки наблюдался на w5 и w8 (рис.5Б, верхняя панель). В частности, спайк S2P ECTO показал самый низкий средний титр ID 50, , 879 и 2481 на w5 и w8, соответственно, тогда как спайк S2GΔHR2 вызывал более сильный ответ NAb со средним значением ID 50 в 2,8-6,7 раз. титры, которые не достигли P ≤ 0,05 из-за внутригрупповых вариаций. Тем не менее, этот результат подтвердил положительный эффект мутации 2G и делеции стебля HR2 на выявление NAb. Среди трех SApNP, E2p показал наилучшие результаты на w5, показав средний титр ID 50 , равный 8435, то есть 9.В 6 раз выше, чем S2P ECTO и в 1,4 раза выше, чем S2GΔHR2, в то время как I3-01v9 показал наиболее сильный ответ NAb на w8 со средним титром ID 50 17 351, что примерно в 7 и 2,5 раза выше чем S2P ECTO и S2GΔHR2 соответственно. Аналогичная временная картина наблюдалась в анализе гетерологичного SARS-CoV-1-pp (рис. 5B, нижняя панель). Стоит отметить, что многослойный SApNP I3-01v9 вызывал ответ NAb SARS-CoV-1 со средним титром ID 50 351 на w2, тогда как во всех других группах не было обнаружено нейтрализации сыворотки.Эти результаты предполагают, что хорошо разработанная вакцина SARS-CoV-2 S2GΔHR2 SApNP может обеспечить защиту от обоих SARS-CoV. Наконец, мы проанализировали ответы NAb, вызванные тремя вакцинами против SARS-CoV-1 (рис. 5C и рис. S9). В аутологичном анализе SARS-CoV-1-pp спайк S2P ECTO и RBD SApNP индуцировали значительно более высокие титры NAb, чем тример RBD на w2 и w5, и все три группы вакцины показали одинаковые титры ID 50 на w2 и w5. w8. Однако нейтрализация гетерологичного SARS-CoV-2 была ниже или на базовом уровне для трех вакцин против SARS-CoV-1 на w2, w5 и w8.В этом исследовании анализ нейтрализации псевдовирусов был подтвержден с использованием панели известных NAb SARS-CoV-1/2 (рис. S9C). В качестве отрицательного контроля сыворотки мышей w8 тестировали против псевдочастиц, несущих Env вируса лейкемии мышей (MLV), MLV-pps, не обнаруживая обнаруживаемой реактивности (фиг. S9D). Таким образом, эти результаты демонстрируют преимущество в выявлении NAb спайком SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и его SApNP по сравнению с широко используемым спайком S2P ECTO . Хотя SARS-CoV-2 RBD– и S2GΔHR2-представляющие SApNP оба эффективны для индукции аутологичного ответа на NAb, последний может индуцировать высокие титры NAb для SARS-CoV-1 и может обеспечить более широкую защиту от SARS-ассоциированных CoV.

Фиг.5. Вакцинальные ответы на NAb, вызванные SARS-CoV-1/2, у мышей BALB / c.

( A ) SARS-CoV-2 RBD и RBD-SApNP вакцинные ответы NAb на аутологичный SARS-CoV-2 (слева) и гетерологичный SARS-CoV-1 (справа). ( B ) Спайк SARS-CoV-2 S2GΔHR2 и индуцированные вакциной S2GΔHR2-SApNP ответы NAb на SARS-CoV-2 (вверху) и SARS-CoV-1 (внизу). В (A) и (B) для сравнения включена группа SARS-CoV-2 S2P ECTO -5GS-1TD0. ( C ) SARS-CoV-1 RBD и RBD-SApNP вакцинные ответы NAb на аутологичный SARS-CoV-1 (слева) и гетерологичный SARS-CoV-2 (справа).В (C) для сравнения включена группа SARS-CoV-1 S2P ECTO -5GS-1TD0. В (A) - (C) нанесены титры ID 50 , полученные из анализов нейтрализации SARS-CoV-1/2-pp, со средними значениями ID 50 , отмеченными на графиках. Значения P были определены с помощью непарного теста t в GraphPad Prism 8.4.3, где (*) указывает уровень статистической значимости. Подробные данные по нейтрализации SARS-CoV-1/2-pp показаны на рис. S7 - S9.

Т-клеточный ответ SARS-CoV-2, индуцированный вакциной

В то время как гуморальный иммунитет необходим для блокирования взаимодействия вируса-хозяина и предотвращения вирусной инфекции, клеточный иммунитет необходим для устранения инфицированных клеток-хозяев с целью контроля вирусной инфекции 88 ).Новые данные указывают на то, что ранний Т-клеточный ответ ( 89 , 90 ), а также Т-клеточная память ( 91 ) имеют решающее значение для защиты от SARS-CoV-2. Однако вакцины против COVID-19 должны индуцировать Т-клеточный ответ CD4 + T H 1, но не T H 2-типа, поскольку последний был вовлечен в ассоциированное с вакциной усиление респираторных заболеваний ( 10 ). Кроме того, T-фолликулярные хелперы (T fh ) играют важную роль в созревании и производстве NAb.Следовательно, понимание ответов Т-клеток имеет решающее значение для разработки эффективной и безопасной вакцины против COVID-19.

Интерферон-γ (IFN-γ) - продуцирующие клетки T H 1 важны для выработки оптимального ответа антител и индукции клеточного иммунитета ( 85 - 87 ). Сначала мы исследовали различные вакцины против SARS-CoV-2 на индукцию ответов CD4 + T H 1, специфичных к вакцинному антигену, на 11-й неделе, через 2 недели после четвертой иммунизации, когда Т-клетки памяти уже развились в селезенке ( 88 ).Спленоциты мышей из группы S2P ECTO и двух групп S2GΔHR2 SApNP (E2p и I3-01v9) анализировали проточной цитометрией с использованием наивных образцов в качестве отрицательного контроля. Группа I3-01v9 индуцировала примерно в 1,5 и 2,3 раза более высокую частоту продуцирующих IFN-γ клеток CD4 + T H 1, чем группы S2P ECTO и E2p, соответственно (рис. 6A). Примечательно, что после рестимуляции соответствующими антигенами в течение всего 4 часов обе группы SApNP продуцировали примерно в 2 раза более высокую частоту CD107a-продуцирующих цитолитических CD4 + Т-клеток, чем S2P ECTO и наивные группы (рис.6Б). Двойные положительные клетки IFN-γ / интерлейкина-4 (IL-4) представляют собой CD4 + Т-клетки памяти, которые приобрели способность продуцировать IL-4, сохраняя при этом способность продуцировать IFN-γ при T H 1 условия ( 92 ). Оказалось, что I3-01v9 индуцировал в три и пять раз больше IFN-γ / IL-4 двойных положительных Т-клеток памяти CD4 + , чем S2P ECTO и E2p (фиг. 6A). Эти результаты предполагают, что I3-01v9 может индуцировать как CD4 + T H 1 клетки, так и IFN-γ / IL-4, дважды положительные CD4 + Т-клетки памяти.Кроме того, I3-01v9 индуцировал больше двойных положительных CD8 + эффекторных Т-клеток IFN-γ / гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), чем S2P ECTO и E2p (фиг. 6C), что позволяет предположить, что защитный CD8 + Т-клетки также генерировались у мышей, иммунизированных I3-01v9. Примечательно, что Т-клетки CD8 + , полученные от мышей, иммунизированных I3-01v9, а не от мышей с S2P ECTO и E2p, приобрели способность быстро продуцировать IFN-γ после рестимуляции антигена (рис.6D), что свидетельствует о генерации I3-01v9-чувствительных эффекторных Т-клеток / Т-клеток памяти. Наши результаты показывают, что SApNP S2GΔHR2 I3-01v9 может индуцировать устойчивые Т-клеточные ответы, состоящие из CD4 + T H 1 клеток, IFN-γ / IL-4 с двойной положительной памятью CD4 + Т-клеток и эффекторных CD8. + Т-клеток, обеспечивая таким образом защитный клеточный иммунитет в дополнение к мощному ответу на NAb. Поскольку нельзя исключить Т-клеточный иммунитет против основы SApNP, может потребоваться более подробный анализ Т-клеток с использованием растворимых спайков, спайковых пептидов и голых SApNP для рестимуляции.

Фиг.6. Т-клеточные ответы, вызванные вакциной SARS-CoV-2, у мышей BALB / c.

спленоцитов мышей ( n = 5 в каждой группе), иммунизированных спайком S2P ECTO , S2GΔHR2 E2p SApNP и S2GΔHR2 I3-01v9 SApNP, были выделены на w11 и культивированы в присутствии IL-2 и дендритных клеток. (DC) в импульсном режиме с S2P ECTO (1 × 10 −7 мкМ), S2GΔHR2 E2p (1 × 10 −7 мкМ) и S2GΔHR2 I3-01v9 (1 × 10 −7 мкМ), соответственно .Спленоциты от пяти наивных мышей использовали в качестве контрольных образцов и культивировали в присутствии DC без пульсации антигена. Клетки оценивали через 16 часов ( A и C ) и 4 часа ( B и D ) культивирования. (A и B) Индуцированный вакциной CD4 + Т-клеточный иммунитет. (C и D) Индуцированный вакциной CD8 + Т-клеточный иммунитет. Графики показывают частоты фракции клеток. Значения P определяли односторонним анализом ANOVA. * P <0.05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

ОБСУЖДЕНИЕ

COVID-19 - первая всемирная пандемия такого масштаба после печально известного испанского гриппа более века назад ( 93 ), который вызвал около 50 миллионов смертей во всем мире и остается болезненным напоминанием о нашей уязвимости перед новым вирусом. без защитной вакцины. Поэтому быстрое распространение SARS-CoV-2 потребовало быстрой разработки вакцины ( 10 ). Операция Warp Speed ​​(OWS) была запущена в мае 2020 года с первоначальной целью доставить 300 миллионов доз безопасных и эффективных вакцин к январю 2021 года ( 94 ), хотя эта цель еще не реализована.Тем не менее, в декабре 2020 года, когда другие вакцины-кандидаты все еще проходили клинические испытания, две мРНК-вакцины, поддерживаемые OWS, были одобрены для EUA, что стало важным поворотным моментом в борьбе с пандемией. Однако разработка вакцины во время пандемии против нового вируса ставит уникальные задачи, одна из которых заключается в том, как сбалансировать потребности общественного здравоохранения с научной строгостью ( 95 - 97 ). Глобальная кампания по вакцинам также предоставляет уникальную возможность сравнить различные стратегии и платформы разработки вакцин, особенно новые, с общей целью.В то время как мРНК и вирусные векторные вакцины остаются лидерами, в недавнем обзоре белковые вакцины освещены с прогнозом, что они в конечном итоге достигнут большей части населения мира ( 98 ). Поскольку титры NAb, вызванные вакцинами на основе нуклеиновых кислот первого поколения, со временем ослабевают, потребуются эффективные белковые вакцины для поддержания долгосрочного иммунитета против SARS-CoV-2.

Здесь мы подошли к вакцине против SARS-CoV-2 с рациональной стратегией дизайна и намеревались разработать вакцины с протеиновыми NP, которые можно использовать отдельно или в качестве бустерной вакцины.С этой целью была создана панель кандидатов в вакцины на основе трех платформ SApNP с различными атрибутами in vitro и in vivo (таблица S1). Наш сравнительный анализ этих вакцинных конструкций дал некоторые ценные сведения. Во-первых, выбор антигена имеет решающее значение для успеха вакцины против SARS-CoV-2 независимо от платформы доставки. Большинство вакцинных антигенов, включая кандидаты в вакцины OWS, основаны на S2P, который дает структуру шипа, которая в деталях отличается от полноразмерного шипа дикого типа, т.е.g., в FPPR S2 и в относительном расположении доменов S1 ( 52 ). Эти различия могут затруднить интерпретацию результатов вакцинации. S2P и другие эмпирические конструкции шипов ( 53 ) пытались ограничить конформацию шипа и увеличить выход тримеров. Однако, как мы ранее продемонстрировали для ВИЧ-1 Env и EBOV GP ( 58 , 60 , 81 ), важно определить и устранить (если возможно) причину метастабильности спайка.Во время антигенного скрининга мы обнаружили, что делеция ножки HR2 с заменой 2P-на-2G обеспечивает более стабильный спайк, что согласуется с недавними сообщениями об очень гибкой ножке HR2 в нативных спайках на вирионах SARS-CoV-2 ( 54 - 56 ). Таким образом, S2GΔHR2, по-видимому, представляет собой серьезный прорыв в конструкции шипов. Во-вторых, однокомпонентные SApNP обеспечивают мощную платформу для разработки вакцины против различных вирусных патогенов ( 57 , 58 , 60 ).Здесь S2GΔHR2 был генетически слит, а не химически связан с тремя SApNP, включая два многослойных 60-мерных носителя с повышенной стабильностью и встроенным Т-справочным сигналом. Эти белковые вакцины должны быть более эффективными в индукции сильного ответа NAb и с меньшей вероятностью вызывать нежелательные реакции ( 98 , 99 ). Стратегия вакцины, ориентированная на эпитопы, также была исследована путем создания каркасных тримеров RBD и SPY-связанных SApNP RBD. В-третьих, для достижения высокой эффективности и обеспечения безопасности перед клиническими испытаниями необходимо оценить индуцированные вакциной NAb и Т-клеточные ответы на животных.В нашем исследовании на мышах S2GΔHR2 оказался более эффективным, чем S2P в выявлении NAb, как отдельно, так и отображаемых на SApNP. Примечательно, что многослойный SApNP S2GΔHR2 I3-01v9 вызывал не только высокие титры NAb, но также желаемые Т-клеточные ответы. Помимо CD4 + T H 1 и CD4 + Т-клеток памяти, этот SApNP также индуцировал CD107a-продуцирующие цитолитические CD4 + Т-клетки, которые могут напрямую убивать инфицированные клетки-хозяева, и GM-CSF– продуцируют эффекторные Т-клетки CD8 + , которые могут способствовать образованию макрофагов и функциональных дендритных клеток (ДК), способствующих удалению инфицированных клеток.Также стоит отметить, что ответ NAb на большие SApNPs стабилизировался после трех доз, предполагая, что количество инъекций и дозировка могут быть уменьшены без уменьшения ответов, индуцированных вакциной. Наконец, экспрессия вакцинных антигенов в клетках СНО с последующей очисткой с использованием колонки с антителами, такой как CR3022, позволит быстрое производство вакцины в промышленных масштабах. Таким образом, наше исследование предоставляет многообещающие вакцины-кандидаты от COVID-19 для оценки в ходе клинических испытаний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн, экспрессия и очистка SARS-CoV-1/2 RBD и антигенов шипа

Гены шипа (S) изолята SARS-CoV-1 Tor2 (номер доступа в GenBank: NC_004718) и Изолят SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (номер доступа в GenBank: MN7) использовали для создания всех конструкций RBD и spike после оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих.Последовательность RBD определяется как P317-D518 и P330-N532 для SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно. Последовательность SEC TO определяется как M1-Q1190 и M1-Q1208 для SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно. Чтобы удалить сайт расщепления S1 / S2, в шипы SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 были введены мутация R667G и модификация 682 GSAGSV 687 соответственно. Мутация 2P (или 2G) была сделана для K968 / V969 и K986 / V987 в шипах SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 соответственно.С-концевую область SARS-CoV-2 (E1150-Q1208), содержащую ножку HR2, удалили из S2G ECTO , в результате чего была получена спайковая конструкция с делецией HR2, названная S2GΔHR2. Вирусный капсидный белок SHP (PDB: 1TD0) был использован в качестве мотива тримеризации в спайковых конструкциях для иммунизации, тогда как фолдоновый домен из фибритина бактериофага Т4 (PDB: 1RFO) использовался для покрытия спайковых антигенов для ELISA, чтобы замаскировать 1TD0- производный ответ антител. Все конструкции временно экспрессировались в клетках ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific).Вкратце, клетки ExpiCHO размораживали и инкубировали со средой для экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific) в шейкере-инкубаторе при 37 ° C, 135 об / мин и 8% CO 2 . Когда клетки достигли плотности 10 × 10 6 мл -1 , добавляли экспрессионную среду ExpiCHO для уменьшения плотности клеток до 6 × 10 6 мл -1 для трансфекции. Комплексы ExpiFectamine CHO / плазмидная ДНК получали для трансфекции 100 мл в клетки ExpiCHO в соответствии с инструкциями производителя.Для данной конструкции 100 мкг плазмиды и 320 мкл реагента ExpiFectamine CHO смешивали в 7,7 мл холодной среды OptiPRO (Thermo Fisher Scientific). После первого кормления в день 1 клетки ExpiCHO культивировали в шейкере-инкубаторе при 33 ° C, 115 об / мин и 8% CO 2 , следуя протоколу Max Titer с дополнительным кормом на 5 день (Thermo Fisher Scientific). Супернатанты культур собирали через 13-14 дней после трансфекции, осветляли центрифугированием при 4000 об / мин в течение 25 минут и фильтровали с использованием фильтра 0.Фильтр 45 мкм (Thermo Fisher Scientific). Колонку с антителами CR3022 использовали для экстракции антигенов SARS-CoV-1/2 из супернатантов, после чего проводили SEC на колонке Superdex 200 10/300 GL (для каркасных тримеров RBD) или колонке Superose 6 10/300 GL ( для SPY-связанных SApNP RBD, шипов и SApNP S2GΔHR2). Человеческий NAb, P2B-2F6 ( 36 ), также использовали для упаковки колонок с антителами для очистки пика SARS-CoV-2 S2GΔHR2, за которым следовали SEC на колонке HiLoad 16/600 Superose 6.Для сравнения, спайковый белок SEC TO -5GS-1TD0 с меткой His 6 экстрагировали из супернатантов с использованием колонки Excel с иммобилизованной Ni-сефарозой (GE Healthcare) и элюировали 500 мМ имидазолом перед SEC. Концентрацию белка определяли с использованием поглощения УФ 280 с теоретическими коэффициентами экстинкции.

Нативный PAGE

синего цвета.

Шипы SARS-CoV-2 и SApNP, представляющие шипы, анализировали с помощью синего нативного PAGE и окрашивали кумасси синим.Белки смешивали с буфером для образцов и загрузочным красителем G250 и добавляли к 4-12% гелю Bis-Tris NativePAGE (Life Technologies). Гели BN-PAGE запускали в течение от 2 до 2,5 часов при 150 В с использованием рабочего буфера NativePAGE (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуноферментный анализ

Каждую лунку 96-луночного аналитического планшета Costar (Corning) сначала покрывали 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,2 мкг соответствующих антигенов.Планшеты инкубировали в течение ночи при 4 ° C, а затем пять раз промывали промывочным буфером, содержащим PBS и 0,05% (об. / Об.) Tween 20. Затем каждую лунку покрывали 150 мкл блокирующего буфера, состоящего из PBS и блокатора для блоттинга. (40 мг мл -1 ) (Bio-Rad). Планшеты инкубировали с блокирующим буфером в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем пять раз промывали промывочным буфером. Для связывания антигена антитела [в форме иммуноглобулина G (IgG)] разводили в блокирующем буфере до максимальной концентрации 5 мкг / мл -1 с последующей серией 10-кратных разведений.Для каждого разведения антител в соответствующие лунки добавляли в общей сложности 50 мкл. Для анализа образцов мышей плазму разбавляли в 20-кратном блокирующем буфере и подвергали серии 10-кратных разведений. Для каждого разведения образца в лунки добавляли в общей сложности 50 мкл объема. Каждый планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем пять раз промывали PBS, содержащим 0,05% твин 20. Для связывания антител использовали разведение 1: 5000 козьих антител против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), или, для анализа образцов мышей, разбавление 1: 3000 меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories) затем готовили в промывочном буфере (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) с 50 мкл этого разбавленного вторичного антитела добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали со вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем шесть раз промывали PBS, содержащим 0,05% Твина 20. Наконец, лунки проявляли 50 мкл триметилбора (Life Sciences) в течение 3-5 минут перед остановкой реакция с 50 мкл 2 н. серной кислоты.Полученные показания планшета были измерены при длине волны 450 нм. Примечательно, что связывание w2 с сывороткой не достигло плато (или насыщения), чтобы обеспечить точное определение титров EC 50 . Тем не менее, значения EC 50 для w2 были получены путем установки нижних / верхних ограничений OD 450 (оптическая плотность при 450 нм) на 0,0 / 3,2, чтобы облегчить сравнение различных групп вакцин в первый момент времени.

Биослойная интерферометрия

Кинетика вакцинных антигенов SARS-CoV-1/2, RBD по сравнению с RBD-представляющими SApNP, а также спайк-по сравнению с представляющими спайк SApNP, связывалась с панелью известных антител (в форме IgG) измерено с помощью прибора Octet RED96 (FortéBio, Pall Life Sciences).Все анализы выполняли при перемешивании со скоростью 1000 об / мин в 1 × кинетическом буфере FortéBio. Конечный объем всех растворов составлял 200 мкл на лунку. Анализы проводили при 30 ° C в твердых 96-луночных планшетах черного цвета (Geiger Bio-One). Для всех антигенов, за исключением SApNP S2GΔHR2, антитело (5 мкг мл -1 ) в 1 × кинетическом буфере загружали на поверхность биосенсоров захвата Fc человека (AHC) на 300 с. Для SApNP S2GΔHR2 использовали биосенсоры количественного определения Fc человека (AHQ). Шаг 60-секундного базового уровня биосенсора применяли перед анализом ассоциации антитела на биосенсоре с антигеном в растворе в течение 200 секунд.Двукратный градиент концентрации антигена, начиная с 950 нМ для каркасных тримеров RBD, 37 нМ для SPY-связанных RBD FR SApNP (RBD-5GS-SPY-5GS-FR), 150 нМ для растворимых шипов и 9 / 3,5 / 3,5 нМ для S2GΔHR2, представленного на SApNP FR / E2p / I3-01v9, использовали в серии из шести титрований. Диссоциация взаимодействия прослеживалась в течение 300 с. Корректировку смещения базовой линии выполняли путем вычитания среднего значения сдвигов, зарегистрированных для сенсора, загруженного антителом, но не инкубированного с антигеном, и для сенсора без антител, но инкубированного с антигеном.Данные октетов обрабатывались программой сбора данных FortéBio v.8.1. Экспериментальные данные были согласованы с уравнениями связывания, описывающими взаимодействие 2: 1 для достижения оптимального соответствия. Следует отметить, что пик S2GΔHR2 также измеряли с использованием биосенсоров AHQ для облегчения сравнения связывания mAb с SApNP, представляющими S2GΔHR2.

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Кривые термического плавления SARS-CoV-2 S2P ECTO -5GS-1TD0 и S2GΔHR2-5GS-1TD0 спайковых белков после очистки CR3022 и SEC были получены с помощью прибора MicroCal PEAQ-DSC Man (Malvern) .Очищенный белок тримера спайков, продуцируемый клетками ExpiCHO, заменяли буфером на 1 × PBS и концентрировали до 0,8 мкМ перед анализом с помощью прибора. Плавление исследовали при скорости сканирования 60 ° C час -1 от 20 ° до 100 ° C. Обработка данных, включая коррекцию буфера, нормализацию и вычитание базовой линии, проводилась с использованием программного обеспечения MicroCal PEAQ-DSC. Подгонка по Гауссу проводилась с использованием программы Origin 9.0.

ЭМ-оценка конструкций NP

ЭМ-анализ различных SApNP, представляющих RBD и S2GΔHR2, был выполнен центром микроскопии ядра в Исследовательском институте Скриппса.Все образцы SApNP были приготовлены в концентрации от 0,01 до 0,05 мг / мл. Покрытые углеродом медные решетки (400 меш) подвергали тлеющему разряду, и 8 мкл каждого образца адсорбировались в течение 2 мин. Избыточный образец был удален, и сетки были отрицательно окрашены 2% уранилформиатом в течение 2 минут. Лишнее пятно было удалено, а сеткам дали высохнуть. Образцы анализировали при 80 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа Talos L120C (Thermo Fisher Scientific), а изображения получали с помощью камеры CETA 16M CMOS (комплементарный металл-оксидный полупроводник).

Иммунизация животных и сбор образцов

Об аналогичных протоколах иммунизации сообщалось в наших предыдущих исследованиях вакцин ( 57 , 58 , 60 ). Вкратце, руководящие принципы Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) соблюдались с животными, испытанными в исследовании иммунизации. Восьминедельных мышей BALB / c были приобретены в лаборатории Джексона и помещены в вентилируемые клетки в комнатах с контролируемой средой в Исследовательском институте Скриппса в соответствии с утвержденным протоколом IACUC и AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными) Международные руководящие принципы.Мышей иммунизировали на w0, w3, w6 и w9 с помощью 200 мкл смеси антиген / адъювант, содержащей 50 мкг вакцинного антигена и 100 мкл адъюванта, AddaVax или Adju-Phos (InvivoGen), внутрибрюшинным путем. Кровь собирали через 2 недели после каждой иммунизации. Все кровотечения проводились через ретроорбитальный синус с использованием гепаринизированных капиллярных пробирок в пробирки, покрытые ЭДТА. Образцы вращали со скоростью 1200 об / мин в течение 10 минут для разделения плазмы (верхний слой) и остальной части слоя цельной крови. После тепловой инактивации при 56 ° C в течение 30 минут плазму вращали при 2000 об / мин в течение 10 минут для удаления осадков.Оставшуюся часть слоя цельной крови разбавляли равным объемом PBS, а затем накладывали на 4,5 мл фиколла в 15-мл пробирке SepMate (STEMCELL Technologies) и центрифугировали при 1200 об / мин в течение 10 мин при 20 ° C для отделения периферических сосудов. мононуклеарные клетки крови (PBMC). Клетки промывали один раз в PBS, а затем ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса красных кровяных клеток ACK (Lonza). После промывания PBS РВМС ресуспендировали в 2 мл Bambanker Freezing Media (Lymphotec). Селезенки собирали на w11 и измельчали ​​против ситечка для клеток 70 мкм (BD Falcon) для высвобождения спленоцитов в суспензию клеток.Спленоциты центрифугировали, промывали в PBS, обрабатывали 5 мл лизирующего буфера хлорида аммония-калия (ACK) (Lonza) и замораживали с помощью 3 мл среды для замораживания Bambanker. Плазму использовали для ELISA и анализов нейтрализации для определения ответов на связывание и NAb в сыворотке мышей.

Анализ нейтрализации псевдовируса SARS-CoV-1/2

Анализы нейтрализации псевдочастиц (SARS-CoV-1/2-pp)

использовали для оценки нейтрализующей активности ранее сообщенных антител и реакции мышиных антител, индуцированной вакциной.SARS-CoV-1/2-pps были получены путем котрансфекции клеток 293T эмбриональной почки человека (HEK) с плазмидой pNL4-3.lucR-E- ВИЧ-1 (полученной из программы реагентов для СПИДа Национального института здравоохранения: www. aidsreagent.org/) и плазмиду экспрессии, кодирующую ген S изолята Tor2 SARS-CoV-1 (номер доступа в GenBank: NC_004718) и изолята SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (номер доступа GenBank: MN7) на Соотношение 4: 1 по данным Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). Через 48-72 часа SARS-CoV-1/2-pps собирали из супернатанта центрифугированием при 4000 об / мин в течение 10 минут, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C перед использованием.MAb в начальной концентрации от 0,1 до 10 мкг / мл или плазму мыши в начальном 100-кратном разведении смешивали с супернатантом, содержащим SARS-CoV-1/2-pps, и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. в 96-луночном планшете с твердым дном белого цвета (Corning). В анализе использовали серию трехкратных разведений. Клеточная линия HEK293T-hACE2 (каталожный номер: NR-52511) и вектор pcDNA3.1 (-), содержащий ген SARS-CoV-2 S (каталожный номер: NR52420), были получены из BEI RESOURCES (www.beiresources.org/ ) и использовались в анализах нейтрализации псевдовирусов ( 84 ).Вкратце, клетки HEK293T-hACE2 при 1 × 10 4 добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. После инкубации вышележащие среды удаляли и клетки лизировали. Сигнал люциферазы светлячков от инфицированных клеток определяли с использованием системы анализа люциферазы Bright-Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Данные были получены с микропланшетного ридера BioTek с программным обеспечением Gen 5, средняя фоновая люминесценция из серии неинфицированных лунок была вычтена из каждой лунки, и кривые нейтрализации были построены с использованием GraphPad Prism 8.4.3, в котором значения из лунок сравнивались с лунками, содержащими только SARS-CoV-1/2-pp. Те же векторы ВИЧ-1, псевдотипированные геном Env MLV, названные MLV-pps, были продуцированы в клетках HEK293T и включены в анализы нейтрализации в качестве отрицательного контроля. Поскольку титры NAb выходили на плато после w8, результаты для w11 не были показаны на фиг. 5, но включены в фиг. S7 - S9 для сравнения.

Продукция DC

Костный мозг мыши культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и рекомбинантный лиганд Flt3 мыши (Flt3L; 50 нг / мл) и фактор стволовых клеток (SCF; 10 нг / мл) в течение 9 дней. описан ( 100 ).Чтобы вызвать активацию DC, незрелые DC инкубировали с липополисахаридом (100 нг / мл) и R848 (резиквимод; 100 нг / мл) в течение ночи, что активировало Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), TLR7 / 8 или TLR9, соответственно. Клетки собирали для экспериментов. ДК были отсортированы для выделения клеток CD11c + с использованием магнитных шариков (Miltenyi Biotec, CA).

Антитела и анализ проточной цитометрии

Все антитела, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания, были приобретены у eBioscience (Сан-Диего, Калифорния), BioLegend (Сан-Диего, Калифорния) или BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния).Антитела, конъюгированные с магнитными микрошариками, и стрептавидин были приобретены в Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Рекомбинантный человеческий белок IL-2 был приобретен в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Рекомбинантный мышиный Flt3L и мышиный SCF были приобретены в Shenandoah Biotech (Warwick, PA). Клетки окрашивали соответствующими концентрациями mAb. Мертвые клетки были исключены с помощью Fixable Viability Dye от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния). Анализы проточной цитометрии выполняли с использованием цитометров LSRII (BD Biosciences, Калифорния) и Canto (Becton Dickinson, Нью-Джерси).Клетки сортировали на BD FACSAria II (BD Biosciences, Калифорния).

Культура и активация Т-клеток

Мононуклеарные клетки селезенки из каждой группы иммунизированных мышей культивировали в присутствии ДК, пульсирующих с S2P или без него ECTO , многослойный S2GΔHR2-представляющий E2P или I3-01v9 SApNP (1 × 10 -7 мкМ) в полной модифицированной среде Дульбекко Искова (IMDM), содержащей IL-2 (5,0 нг / мл). Клетки собирали через 16 и 4 часа для окрашивания внутриклеточных цитокинов и анализа проточной цитометрии.

Статистика

Для анализа антител сравнения различных групп вакцины были выполнены в GraphPad Prism 8.4.3 с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t . Для анализа Т-клеток сравнение средних значений проводили с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t , дисперсионного анализа (ANOVA), а затем апостериорного теста t . P Значения 0,05 или меньше считались значимыми.

Благодарности: Финансирование: Эта работа финансировалась грантами NIH AI129698 и AI140844 (J.Z.), Ufovax / SFP-2018-0416, Ufovax / SFP-2018-1013 и Ufovax / SFP-2020-0111 (к J.Z.). Вклад авторов: Дизайн проекта: L.H., Y.Z., I.A.W. и J.Z .; конструкция конструкции RBD и иммуногенов на основе шипов L.H. и J.Z .; плазмидный дизайн и обработка L.H. and C.S .; производство, очистка и базовая характеристика антигена L.H., X.L. и T.N .; производство антител и упаковка колонок L.H., X.L. и T.N .; ELISA антитело-антиген и BLI от L.H. and C.S .; DSC Л.Х. и Дж.Z .; негативное окрашивание EM от L.H. and J.Z .; ELISA плазма-антиген от L.H., X.L. и C.S .; нейтрализация антител и плазмы мыши с помощью L.H. и X.L .; анализ индуцированного вакциной Т-клеточного ответа, проведенный Y.W., C.A. и Y.Z .; рукопись, написанная L.H., Y.Z., I.A.W. и J.Z. Всех авторов попросили прокомментировать рукопись. Номер рукописи TSRI: 30028. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у соответствующего автора.

Новые иммунотерапевтические препараты нацелены на два ускользающих белка, вызывающих рак | Наука

Т-клетки, атакующие опухолевые клетки

МАУРИЦИО ДЕ АНДЖЕЛИС / Источник в науке

Автор: Джоселин Кайзер,

Исследователи показали на мышах, что дизайнерские антитела могут сдерживать рост опухолей, нацеливаясь на двух самых печально известных виновников рака - белки RAS и p53, которые мутируют во многих опухолях, но в значительной степени бросают вызов усилиям по разработке лекарств. Если их обещание подтвердится в клинических испытаниях, такие лекарства могут дать возможность иммунной системе организма бороться с трудноизлечимыми формами рака, включая рак поджелудочной железы и яичников.

«Это захватывающе», - говорит иммунолог Джон Вейданц из Техасского университета в Арлингтоне, который стал соучредителем компании, которая занимается аналогичными видами иммунотерапии, называемыми биспецифическими антителами.Новые препараты могут фиксироваться на нескольких фрагментах p53 или RAS, выступающих с поверхности опухолевой клетки, а затем запускать иммунные клетки для их атаки. «Терапия может сработать, когда на клетках действительно мало мишеней. Это большое дело », - говорит Вейданц, который написал комментарий к газетам.

P53 является супрессором опухолей, а неповрежденный белок помогает здоровым клеткам восстанавливать ДНК - или самоуничтожаться, если повреждение не может быть исправлено. Когда р53 выключен в опухолях, они могут бесконтрольно расти.Но нацелить p53 с помощью лекарств сложно, потому что восстановить его активность намного сложнее, чем подавить его активность или выключить его производство - более типичные лекарственные стратегии против неправильно функционирующих белков.

RAS, который сигнализирует клеткам о неконтролируемом росте при мутации, было трудно нацелить с помощью ингибиторов из-за его гладкой формы и отсутствия очевидных сайтов связывания.

И оба белка функционируют внутри клеток, что затрудняет борьбу с ними с помощью сконструированных антител, версий Y-образных белков, которые наша иммунная система использует, чтобы пометить чужеродных захватчиков для уничтожения.Антитела не могут легко проникнуть внутрь клеток, поэтому лекарства на их основе лучше всего работают против раковых белков, которые выходят из поверхности опухолевой клетки.

Но даже несмотря на то, что RAS и p53 остаются внутри опухолевых клеток, на поверхности клетки есть их следы, фрагменты, которые может уловить иммунная система. Чтобы нацелить эти фрагменты мутантного p53 и RAS, известные как неоантигены, лаборатория генетика рака Берта Фогельштейна из Университета Джона Хопкинса обратилась к биспецифическим антителам. Стандартные антитела имеют два идентичных плеча, но биспецифические созданы так, чтобы иметь одно плечо, которое связывается с иммунными солдатами, называемыми Т-клетками, а другое - с поверхностным белком раковой клетки, соединяя клетки и активируя иммунную клетку для атаки на своего нового, злокачественного партнера. .

Проблема заключалась в том, что кусочки мутантного p53 и RAS, на которые могло нацеливаться антитело, чрезвычайно редки для опухолевых клеток - менее 10 копий на клетку, как выяснили исследователи. На открытие биспецифического антитела, которое могло бы связываться с ними, но не со здоровыми клетками, понадобилось более 5 лет аспирантам Хопкинса Эмили Сюэ и Жаклин Дуглас и их команде. Во-первых, они протестировали библиотеку фрагментов антител, чтобы найти те, которые прилипли к неоантигенам p53 и RAS. Затем они преобразовали эти фрагменты в различные конструкции биспецифических антител и проверили, какие из них лучше всего побуждают Т-клетки убивать раковые клетки в чашке.По словам молекулярного биолога Шибин Чжоу из Хопкинса, который был одним из руководителей работы, эта стратегия была «осознанным методом проб и ошибок».

В конце концов, команда разработала «диатело», нацеленное на р53, компактное двуплечье антитело, лишенное основы типичного Y-образного антитела. У мышей с опухолевыми клетками, несущими специфическую мутацию в гене p53, эта биспецифичность резко сдерживает рост опухоли, сообщают исследователи сегодня в Science . Два отдельных диатела RAS хорошо работали на линиях культивируемых клеток с двумя разными мутациями, способствующими развитию рака, и незначительно замедляли рост опухолей у мышей, пишет сегодня команда в Science Immunology .В третьем исследовании, проведенном научным сотрудником Суманом Полом, тот же тип урезанных антител с двойной мишенью также работал у мышей против типа лейкемии, в которой участвуют Т-клетки, сообщают они в Science Translational Medicine . Его мишенью был еще один трудноизлечимый вид рака.

Исследования идут с оговорками. Для лечения пациентов исследователи должны были бы разработать панель биспецифических антител, адаптированную как к иммунным белкам человека, так и к конкретным генетическим мутациям p53 или RAS в их опухоли.(Биспецифичность лейкемии также должна соответствовать Т-клеточному раку пациента.) Поскольку у них отсутствует Y-ствол нормальных антител, диатела исчезают из кровотока быстрее, поэтому их придется вводить непрерывно в течение нескольких недель с помощью помпы. пациентом. «Есть разные пути по многим причинам», - говорит Фогельштейн, описывая сегодняшнюю работу на онлайн-встрече «Успехи в области геномной биологии и технологии».

Тем не менее, сторонние исследователи полны энтузиазма. Хотя другие группы также работают над биспецифическими антителами, которые нацелены на белки внутриклеточного рака, «это, по-видимому, один из первых агентов, направленных на мутантный P53, критический супрессор опухолей», - говорит ученый-врач Дэвид Шейнберг из Мемориального онкологического центра им. Слоуна Кеттеринга. консультирует биотехнологические компании, работающие в этой сфере.(Хопкинс подал заявки на патенты, связанные с лечением.)

И хотя исследователи добиваются прогресса в разработке других лекарств от рака с РАС, эти препараты не задействуют иммунную систему и, вероятно, перестанут работать в течение 1 года, поскольку опухоли станут устойчивыми, прогнозирует Вайданц. Биспецифические антитела, которые могут спровоцировать широкий иммунный ответ, предлагают «потенциал для более крупномасштабной войны, в которой, будем надеяться, иммунная система сможет победить».

белков, связанных с главным геном аутизма, могут помочь в ранней диагностике | Спектр

Меры мутации: Уровни определенных белков в крови могут помочь объяснить, почему мутации в PTEN могут иметь различные эффекты.

rost9 / Adobe Stock

Согласно новому исследованию, уровень в крови белков, связанных с геном PTEN, связанным с аутизмом, может влиять на течение заболевания. По словам исследователей, тесты, измеряющие эти молекулы, также могут помочь клиницистам диагностировать аутизм и другие неврологические состояния и наметить их траектории.

«Возможно, мы сможем сделать полезные клинические прогнозы относительно исходов, которые могут помочь раньше адаптировать вмешательства и помочь пациентам и их семьям спланировать то, что необходимо», - говорит ведущий исследователь Томас Фрейзер, профессор психологии Университета Джона Кэрролла в Юниверсити-Хайтс. Огайо.

Ген PTEN кодирует белок, который подавляет опухоли, а также влияет на связи между нейронами. Мутации в PTEN связаны не только с доброкачественными опухолями и несколькими типами рака, но также с аутизмом и макроцефалией или с необычно большой головой.

Однако многое остается неизвестным о том, почему мутации PTEN могут по-разному влиять на людей с аутизмом и без него. Например, мутации PTEN часто связаны с нарушением психической функции у аутичных людей, но не так часто у людей, не страдающих аутизмом, чьи черты могут широко варьироваться.

В новом исследовании Фрейзер и его коллеги изучили, как мутации влияют на уровень в крови не только белка PTEN, но и белков, с которыми он взаимодействует.

Молекулярные ссылки:

Команда оценила уровни различных белков в крови, а также коэффициент интеллекта (IQ) и другие факторы, связанные с умственной функцией, у 25 аутичных и 16 неаутичных участников с мутациями PTEN и макроцефалией, всем в среднем около 9 лет. Исследователи также обследовали 20 участников, в среднем около 14 лет, с аутизмом, макроцефалией и отсутствием мутаций PTEN.

Ученые выяснили, что уровень белка

PTEN отражает оценку умственной функции. Например, хотя участники с мутациями PTEN обычно имели самый низкий уровень белка PTEN, участники с высокими уровнями во всех трех группах, как правило, имели более низкие IQ, рабочую память, языковые способности и другие показатели когнитивных навыков.

«Это меня удивило - я ожидал, что чем ниже уровни PTEN, тем хуже будет IQ», - говорит Худа Зогби, профессор молекулярной генетики и генетики человека в Медицинском колледже Бейлора в Хьюстоне, штат Техас, который не принимал участия в исследовании.

Участники с повышенным уровнем PTEN могут иметь обильные, но ненормальные версии белка, полагают Фрейзер и его коллеги.

«Если у них более высокий уровень белка, но это не функциональный белок, это может быть хуже, чем отсутствие копии гена этого белка», - говорит Зогби.

Более высокие уровни двух связанных с PTEN молекул - протеинкиназы AKT и ингибитора фермента p27 - также отслеживаются с улучшением психической функции. Оба белка могут помочь изменить эффекты мутаций PTEN, что может объяснить, почему мутации PTEN могут по-разному влиять на поведение и когнитивные навыки, говорит Фрейзер.Результаты появились в январе в Molecular Autism .

Номера игра:

Кроме того, аутичные дети с мутациями PTEN и макроцефалией имели контрольные уровни в крови двух других белков: пониженный MnSOD, который помогает катализировать реакции в митохондриях, и повышенный P-S6, который помогает регулировать метаболизм. Исследование предполагает, что поиск этой закономерности может облегчить раннюю диагностику.

Одним из ограничений новой работы является то, что она включала относительно небольшое количество участников с мутациями PTEN, предупреждает Фрейзер.Он и его команда планируют со временем привлечь больше участников, чтобы помочь проверить результаты и узнать, какие белки играют важную роль.

«Может быть, это поможет решить, какие меры лучше подходят для одной группы, чем для другой», - говорит Зогби.

«Дальнейшие исследования также должны включать большее количество белков», - говорит Мерлин Батлер, профессор психиатрии и педиатрии Канзасского университета в Канзас-Сити, который не принимал участия в этой работе.

«Им необходимо охарактеризовать, являются ли мутации PTEN очень серьезными изменениями, когда белок поврежден, или менее серьезными, когда белок все еще функционирует», - говорит Батлер.«Но это хорошая отправная точка».

Исследователи разрабатывают новый высокоселективный инструмент для изучения «не поддающихся обработке» белков через сахара, от которых они зависят

Разделив ферменты для создания своих инструментов редактирования, исследовательская группа предотвратила все нецелевые эффекты; последнее изображение на этой панели показывает, что объединенные ферменты не влияют на расположение белка в клетке. Предоставлено: Woo lab

Сахар называют «злым», «ядовитым» и «ядовитым».«Но организму тоже нужен сахар. Молекулы сахара помогают клеткам распознавать вирусы и бактерии и бороться с ними, перемещают белки от клетки к клетке и обеспечивают функционирование этих белков. Слишком много или слишком мало может способствовать возникновению ряда заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания. как болезнь Альцгеймера, воспаление, диабет и даже рак.

Около 85 процентов белков, включая те, которые связаны с болезнями Альцгеймера и Паркинсона, недоступны для существующих лекарств.Один критически важный и обильный сахар (O-GlcNAc, произносится как o-glick-nack) обнаружен в более чем 5 000 белков, часто считающихся «неподдающимися обработке». Но теперь исследователи из Гарвардского университета разработали новый высокоселективный карандаш и ластик O-GlcNAc - инструменты, которые могут добавлять или удалять сахар из белка без побочных эффектов - чтобы точно изучить, что эти сахара делают, и, в конечном итоге, , разработайте для них новые методы лечения «непреодолимого».

«Теперь мы можем начать изучать определенные белки и посмотреть, что происходит, когда вы добавляете или удаляете сахар», - сказал Даниэль Рамирес, соавтор статьи, опубликованной в Nature Chemical Biology , и доктор философии.Кандидат биологических и биомедицинских наук в Высшей школе искусств и наук. «Это оказывается очень важным при многих хронических заболеваниях, таких как рак, диабет и болезнь Альцгеймера».

Рамирес разработал оригинальный карандаш O-GlcNAc, о котором сообщалось в ACS Chemical Biology .

Все клетки содержат множество сахаров (называемых гликанами), но, как известно, их трудно изучать. Современные инструменты обеспечивают либо широкоугольный обзор (включение или выключение всех O-GlcNAc в клетке), либо ультра-увеличенный обзор (включение или выключение одного сахара на одной аминокислоте на одном белке).Ни одна из этих точек зрения не может показать, что молекулы O-GlcNAc делают с белком в целом, - важнейшее открытие, которое позволило бы исследователям связать точки от O-GlcNAc с болезнью.

«Используя подход на уровне белка, мы восполняем недостающий важный элемент», - сказала Кристина Ву, доцент химии и химической биологии, руководившая исследованием. Инструмент ее лаборатории похож на теплую миску с кашей Златовласки: не слишком широкую, не слишком специфичную. В самый раз.

«Как только у вас появится какой-либо интересующий белок, - сказал первый автор и доктор наук Юн Гэ, - вы можете применить этот инструмент к этому белку и непосредственно посмотреть на результаты». Ge разработал ластик O-GlcNAc, который, как и карандаш, использует нанотело в качестве устройства поиска белка. Инструмент тоже можно адаптировать; пока существует нанотело для выбранного белка, инструмент может быть модифицирован для нацеливания на любой белок, для которого существует самонаводящееся нанотело.

Нанотело является важным компонентом, но у него есть ограничения: остается ли оно прикрепленным к целевому белку, все еще под вопросом, и молекула может изменить функцию или структуру белка, прилипнув.Если клеточные изменения не могут быть окончательно связаны с содержанием сахара в белке, это искажает данные.

Ву и ее лаборатория разработали пару карандашей / ластика, чтобы писать и стирать важный сахар из белков, что является важным шагом для понимания того, как эти сахара влияют на белки и их связь с такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона. Предоставлено: Крис Сниббе / Гарвардский университет.

Чтобы обойти эти потенциальные ограничения, команда разработала свои карандаши и ластики так, чтобы они были «каталитически мертвыми», - сказал Ву.Кастрированные ферменты не будут вносить нежелательных изменений в свой целевой белок. И они могут как добавлять, так и удалять сахар, в отличие от предыдущих инструментов, которые вызывают постоянные изменения. Конечно, как только они соединяют определенную функцию белка с O-GlcNAc, они могут затем использовать эти инструменты для увеличения и определения точного местоположения этих сахаров, которые захватывают и модифицируют белок.

Некоторые сотрудники лаборатории Ву уже используют комбинацию карандаш / ластик для изучения O-GlcNAc на живых животных.Один, например, использует плодовых мушек для изучения того, как сахар влияет на белок, связанный с болезнью Альцгеймера. Сахар также связан с прогрессированием болезни Паркинсона: «Если вы потребляете меньше глюкозы, - сказал соавтор Рамирес, - тогда вы не сможете производить этот сахар внутри клеток». Это означает, что организм не может прикрепить сахар к белкам, что вызывает широкомасштабные изменения в клетках, усугубляя болезнь. При диабете избыток сахара вызывает аналогичные глобальные нарушения; и раковые клетки, как правило, едят много сахара.Теперь, с помощью пары карандаш / ластик лаборатории Woo, исследователи могут точно определить, как эти сахара влияют на различные белки, и приступить к разработке лекарств, чтобы обратить вспять негативные эффекты.

Затем команда планирует настроить свой инструмент, чтобы добиться еще большего контроля. Например, с помощью оптогенетики они могут включать и выключать сахар с помощью вспышки света. Заменив нанотела на небольшие молекулы (используемые в традиционном дизайне лекарств), они могли приблизиться к новым методам лечения. Они также разрабатывают ластик для ластика - инструмент с выключателем - и планируют включить нанотела, которые могут нацеливаться на естественный белок (для этого исследования они пометили белки, чтобы нанотело могло их найти).«Мы в основном пытаемся сделать систему более естественной и работать так же, как клетка», - сказал Рамирес.

Ву также планирует исследовать, как O-GlcNAc может влиять на традиционно «неподдающиеся обработке» белки, называемые факторами транскрипции, которые включают и выключают гены. Если O-GlcNAc играет роль в этом процессе, сахара также могут быть созданы для изучения и регулирования функции генов.

«Мы действительно не знаем, что люди найдут, когда мы дадим им эти инструменты», - сказал Рамирес.Инструмент может быть новым, но потенциал огромен: «В основном мы работаем с iPhone, - продолжил он, - но мы уже работаем над следующими двумя поколениями».


Белки, покрывающие сахар, могут помочь понять заболевание мозга
Дополнительная информация: Юн Ге и др., Дегликозилирование целевого белка в живых клетках с помощью слитой с нанотелом расщепленной O-GlcNAcase, Nature Chemical Biology (2021).DOI: 10.1038 / s41589-021-00757-у Предоставлено Гарвардский университет

Ссылка : Исследователи разрабатывают новый высокоселективный инструмент для изучения белков, не поддающихся обработке, через сахара, от которых они зависят (2021, 11 марта) получено 22 марта 2021 г. с https: // физ.org / news / 2021-03-высокоселективный-инструмент-undruggable-protein-sugars.html

Этот документ защищен авторским правом.

Комментировать

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *