В тягах: Кавказский сленг… — zionistman — LiveJournal

IE Кованые шатуны VW и Audi 144X20

УЛУЧШАЙТЕ УДИЛИЩА ДЛЯ ВЫСОКОЙ НАДЕЖНОСТИ МОЩНОСТИ

IE модернизируют слабые стоковые узлы без замены заводских поршней. Усильте свой двигатель VW / Audi EA113 FSI для увеличения турбонаддува или большего наддува и обеспечения надежной работы двигателя.

Характеристики продукта

• Вставной шток Конический штифт 20 мм для использования только со стандартными поршнями 20 мм

• Кованые из вакуум-вытянутой стали 2 шт. 4340 хром-молибденовая сталь

• Модернизированная конструкция двутавровой балки значительно увеличивает прочность и долговечность.

• Комбинированные испытания до 700 л.с. на 4-цилиндровых двигателях

• Включает стержневые болты IE Spec ARP 2000 со штампом «IE» для гарантии подлинности продукта.

• Индивидуальная оптимизированная с помощью компьютера конструкция для соответствия уникальным двигателям VW / Audi

• Отточено с точностью до 250 миллионных долей дюйма

• Дополнительная принудительная смазка булавки (сверление нарезной) для увеличения срока службы булавки

• Каждый комплект шатунов сбалансирован до веса в пределах +/- 1 грамм.

• Размеры и магнитный поток проверены для обеспечения максимальной надежности

• Многоступенчатая термообработка для стабильности размеров и усталостной долговечности

ОБЗОР

При увеличении выходной мощности вашего EA113 2.0T FSI, внутренние детали начинают выходить из строя, поскольку они выходят далеко за пределы исходных заводских спецификаций. Кованые шатуны Integrated Engineering разработаны для замены заводских единиц и взяли верх над современными модификациями с высокой выходной мощностью. Двигайтесь быстро и надежно со штангами IE, которые гарантированно поддерживают мощность 700 л.с.!

ЗАДВИЖНАЯ ШТАНГА

IE разработаны для использования со стандартными 20-миллиметровыми поршнями с коническими пальцами в вашем двигателе.Никаких модификаций или машинной работы не требуется, что упрощает и ускоряет модернизацию шатуна. Большинство сборок с использованием стержней можно сделать с блоком, оставшимся в транспортном средстве. Идеально подходит для производителей двигателей, которые хотят увеличить мощность сверх стандартных штоков, но пределы мощности штатных поршней еще не достигнуты.

ТЕХНИЧЕСКИЕ РАЗМЕРЫ

• От центра к центру: 144 мм
• Диаметр булавки: 20 мм
• Ширина цапфы большого конца: 24.90 мм
• Стиль штифта: конический шток для стандартных 20-миллиметровых поршней
• Диаметр шейки большой головки: 50,60 мм
• Средний вес штанги (с болтами): 552 грамма
• Размеры стержневого болта: 3/8 «x 1,5» UHL

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ

ДИЗАЙН ДВИГАТЕЛЯ

Двутавровая балка — это рабочая лошадка нашей линейки шатунов. Эта конструкция отличается прочностью, долговечностью, жесткостью и жесткостью. Шатуны IE с двутавровой балкой — отличное обновление по сравнению с более слабыми заводскими устройствами.

ОПТИМИЗАЦИЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА

Все штоки IE разработаны специально для применения с учетом соответствующего давления в баллоне и других факторов, зависящих от применения. При разработке каждого приложения мы используем наши обширные европейские знания о двигателях.

СВЕРЛЕНИЕ ДЛЯ ВИНТОВ

Также называемое принудительной смазкой пальца (FPO), сверление с помощью винтовки увеличивает срок службы булавки на запястье, обеспечивая дополнительную смазку. Это обновление настоятельно рекомендуется для уличных автомобилей, на которых установлен пробег. Винтовка сверлильная продается отдельно в этом приложении .

ОТДЕЛЕННЫЙ ДОМ

Хонингование головки шатуна на собственном современном оборудовании обеспечивает правильную установку допусков для обеспечения надлежащей работы подшипника. Удилища более низкого качества часто не оттачивают с таким вниманием к деталям.

МАТЕРИАЛ КОВАНЫЙ 4340

Сделанные из прочных и долговечных поковок 4340, состоящих из двух частей, эти удилища выдержат практически все, что вы можете в них бросить.

БОЛТЫ ШТАНГИ ​​IE / ARP

Все штанги IE стандартно поставляются с болтами штанги ARP 2000. Болты штанги, входящие в каждый набор штанг IE, имеют штамп с буквами «IE», чтобы гарантировать, что у вас есть настоящий набор штанг IE.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОМЕНТА МОМЕНТОВ ШТОКА ARP 2000 В КОМПЛЕКТЕ

* Следующие характеристики крутящего момента относятся к прилагаемым стержневым болтам ARP 2000 3/8 дюйма с использованием только входящей в комплект смазки ARP. Не следуйте этому руководству, используя ARP +625, другие смазочные материалы для сборки или альтернативные болты.

Предпочтительный метод измерения нагрузки на болт — это измеритель растяжения болта. Входящие в комплект болты ARP 2000 необходимо затянуть и измерить растяжение до 0,006 дюйма с использованием входящей в комплект смазки для сборки ARP.

КЛЮЧ МОМЕНТНЫЙ

При использовании высококачественного динамометрического ключа сначала убедитесь, что динамометрический ключ не уронили и он правильно откалиброван. Не откалиброванный динамометрический ключ может привести к недостаточному / чрезмерному крутящему моменту и выходу из строя стержневого болта.Затяните каждый болт штанги с конечным моментом 50 футов / фунт. Мы рекомендуем затягивать болт, ослаблять его и повторно затягивать болт по 3 раза на каждый болт. Это обеспечивает надлежащее растяжение болта штока и полную посадку крышки штока. Не превышайте 50 футов / фунт. Эти характеристики крутящего момента основаны на прилагаемой смазке для сборки ARP.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

являются одними из компонентов двигателя, которые подвергаются наибольшим нагрузкам, и поэтому требуют особого внимания к деталям для обеспечения надлежащей работы и надежности.Комплексное проектирование гарантирует успех вашей следующей сборки двигателя, подвергая каждый комплект шатунов строгому процессу контроля качества. В течение многих лет стержни с двутавровыми балками Integrated Engineering были неотъемлемой частью обеспечения мощности, необходимой для самых мощных турбоустановок и гоночных двигателей.

Особое внимание было уделено даже мельчайшим деталям, таким как выступы подшипников, посадка пальца на запястье и боковой зазор шатуна, что обеспечивает такой уровень посадки и отделки, которого нет больше нигде.Каждый комплект проходит чистовую механическую обработку и хонингование на заводе для получения идеальных круглых отверстий и отверстий большого диаметра, что обеспечивает самый низкий уровень отказов в отрасли. Все удилища этой серии имеют обильную смазку булавки на запястье и дополнительное сверление для винтовки. Одним из отличительных признаков высококачественного шатуна является соотношение прочности и веса. Чтобы достичь этого баланса прочности и легкости, наша оптимизированная конструкция двутавровой балки используется и проверяется с использованием современных методов проектирования CAD и анализа FEA. Эти методы гарантируют, что удилище будет максимально легким и прочным, идеально подходящим для современных мощных и высокоскоростных европейских приложений.

ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ АВТОМОБИЛЯ

• AUDI-A4 2005-2008 (B7) Двигатели 2.0T EA113 TFSI *
• AUDI — A6 2005-2011 (C6) Двигатели 2.0T EA113 TFSI *
• AUDI — A6 Allroad 2005-2011 (C6) 2.0T EA113 Двигатели TFSI *
• AUDI — TT 2008-2015 (MK2 — 8J) Двигатели 2.0T EA113 TFSI *
• AUDI — A3 2006-2013 (MK2 — 8P) Двигатели 2.0T EA113 TFSI *
• VW — GTI 2006-2009 (MK5) Двигатели 2.0T EA113 FSI *
• VW — Jetta и Jetta GLI 2006-2010 (MK5) 2.0T EA113 Двигатели FSI *
• VW — Passat 2006-2010 (B6) Двигатели 2.0T EA113 FSI *
• VW — EOS 2006-2015 (1F7) Двигатели 2.0T EA113 FSI *

* КОДЫ ДВИГАТЕЛЯ: BUL, BWA, BWE, BWT и BYK

* ПОДХОДИТ ТОЛЬКО ДЛЯ ПОРШНЕЙ ЗАПЯСТЬЯ С КОНУСНЫМИ ШТИФТАМИ 20 ММ

ДОСТУПНЫЕ ШТОКОВЫЕ ПОДШИПНИКИ

Штанговые подшипники Mahle Motorsport Performance — Номер детали IE: MAH-VC1027

Подшипники штока с покрытием Calico / ACL — Номер детали IE: CAL-4B1606H

Сменные подшипники штока OE — Номер детали IE: OEM-18T-RBSET

Эти стержни подходят для VW / Audi EA113 2.Двигатели 0T FSI, используемые во многих шасси VW / Audi, являются прямой заменой заводского штока при установке только заводских поршней с коническим коническим пальцем диаметром 20 мм. Этот шатун несовместим с вторичными или заводскими поршнями с большими или неконусными пальцами запястья.

Рекомендуем устанавливать выступы подшипников обращенными к выхлопной стороне двигателя.

Да, все соединительные стержни Integrated Engineering сделаны из прочных и долговечных поковок 4340. Эти поковки намного превосходят качество большинства заводских прутков, которые обычно изготавливаются из порошкового металла в целях экономии.

Мы рекомендуем как минимум использовать новый комплект шатунных подшипников при установке шатунов.

IE поставляются Вам в «готовом к установке» состоянии. Однако при восстановлении двигателя могут потребоваться другие машинные работы с двигателем, такие как укладка блока или расточка и хонингование стенок цилиндров.

Поскольку штанги IE продаются в сбалансированных наборах, это не требуется.Для приложений с экстремальной производительностью это все еще можно сделать при желании.

На максимальный предел числа оборотов может влиять множество факторов. В этом случае мы рекомендуем не превышать 8500 об / мин с болтами ARP 2000. Если вы планируете превысить этот уровень об / мин, подумайте о замене болтов ARP 625+.

Вообще говоря, условия высоких оборотов подвергают наибольшую нагрузку на болты штока, поскольку шток и крышка буквально тянутся в противоположных направлениях.Если вы планируете продвигать свой двигатель далеко за пределы заводской красной черты или 8500 об / мин, мы рекомендуем обновить его до 625+ болтов ARP.

Винтовка сверлить не требуется. Тем не менее, мы настоятельно рекомендуем его для повседневных водителей и приложений с большим пробегом. Доказано, что сверление винтовки продлевает срок службы пальца кисти и втулки, а также на протяжении многих лет использовалось в нескольких заводских шатунах VW / Audi.

Многие автомобили VW и Audi высокой мощности используют тяги IE. Мы оцениваем наши 4-цилиндровые штанги двутавровой балки на 700+ л.с. Если вы планируете превысить эти уровни, мы рекомендуем перейти на наши тосканские двутавровые стержни.

Являясь одним из компонентов двигателя, подвергающихся наибольшей нагрузке, есть несколько факторов, которые могут способствовать отказу.Чаще всего неисправность вызывается неправильной установкой с последующей неправильной настройкой. Мы рекомендуем вам обратиться за профессиональной помощью как по установке, так и по настройке. Исправность масляной системы также важна для обеспечения безопасной работы двигателя. Кратковременное масляное голодание может привести к поломке подшипников качения и двигателя. В экстремальных условиях также убедитесь, что вы используете усиленные булавки для запястий. На многие предлагаемые нами поршни мы либо включаем прочные штифты для запястий, либо предлагаем их в качестве модернизации.

ВИДЕО:

Кинетика экзоцитоза в колбочках быстрее, чем в стержнях

Abstract

Ответные реакции нейронов сетчатки второго порядка, управляемые конусами, значительно быстрее, чем ответы, управляемые стержнями.Мы исследовали, могут ли различия в кинетике высвобождения синаптического медиатора из палочек и колбочек вносить вклад в различия в кинетике постсинаптического ответа. Экзоцитоз из палочек и колбочек запускался деполяризацией мембраны и контролировался двумя способами: (1) путем измерения EPSC, вызванных в нейронах второго порядка, посредством шагов деполяризации, применяемых к пресинаптическим палочкам или колбочкам во время одновременной парной регистрации целых клеток, или (2) путем прямого измерения экзоцитотического увеличения емкости мембраны.Кинетику высвобождения оценивали путем варьирования продолжительности этапа испытания на деполяризацию. Оба показателя высвобождения выявили два кинетических компонента увеличения экзоцитоза в зависимости от продолжительности ступенчатой ​​деполяризации. В дополнение к медленным устойчивым компонентам в обоих типах клеток, начальный быстрый компонент экзоцитоза имел постоянную времени <5 мс в колбочках, что в> 10 раз быстрее, чем у палочек. Различия между стержнями и конусами в кинетике высвобождения были подтверждены линейной корреляцией между увеличением емкости, вызванной деполяризацией, и переносом заряда EPSC.Эксперименты с изолированными стержнями показывают, что более медленная кинетика экзоцитоза стержней не была результатом соединения стержень-стержень. Первоначальное быстрое высвобождение пузырьков из колбочек может формировать постсинаптический ответ и может вносить вклад в более быстрые ответы управляемых колбочками клеток, наблюдаемых при смещении света.

Введение

В сетчатке позвоночных фоторецепторы палочек и колбочек относительно деполяризованы в темноте с мембранными потенциалами от -35 до -45 мВ, что позволяет тоническому высвобождению нейромедиатора l-глутамата через непрерывный цикл экзоцитоза и эндоцитоза.Вызванные светом гиперполяризующие реакции фоторецепторов по амплитуде градуируются по амплитуде с интенсивностью. Для плавного и непрерывного изменения высвобождения медиатора с изменениями мембранного потенциала фоторецепторы используют кальциевые каналы L-типа, которые демонстрируют устойчивую активацию (Corey et al., 1984; Wilkinson and Barnes, 1996; Schmitz and Witkovsky, 1997; Thoreson et al., 1997). ).

Управляемые конусом световые ответы нейронов сетчатки второго порядка (биполярные и горизонтальные клетки) значительно быстрее, чем световые ответы, управляемые стержнями (Witkovsky and Stone, 1983).Световые реакции колбочек также в 5-10 раз быстрее, чем световые реакции стержней (Baylor, Hodgkin, 1973; Pasino, Marchiafava, 1976). Более быстрая кинетика световых ответов колбочек по сравнению с ответами палочек в первую очередь объясняется различиями в гомеостазе внешнего сегмента Ca ²⁺ и инактивацией каскадных ферментов Ca ²⁺ (для обзора см. Korenbrot and Rebrik, 2002). Однако более быстрые постсинаптические ответы нейронов, управляемых колбочками, являются не просто следствием более быстрых световых ответов колбочек, но также включают более быструю синаптическую передачу по конусному пути.Путем одновременной регистрации фоторецепторов и ганглиозных клеток Бейлор и Феттиплейс (1977) обнаружили, что ответы ганглиозных клеток на деполяризующий ток, введенный в колбочки, были примерно в три раза быстрее, чем ответы, управляемые стержнями. И, сравнивая одновременно зарегистрированные световые ответы в фоторецепторах и горизонтальных клетках из глазного стакана черепахи, Копенгаген и его коллеги (Schnapf and Copenhagen, 1982; Copenhagen et al., 1983) пришли к выводу, что импульсные отклики синапсов палочек и колбочек были похожи по форме, но В 8-10 раз быстрее для синаптического выхода конуса.

В настоящем исследовании мы непосредственно исследовали кинетику экзоцитоза из палочек и колбочек в препарате среза сетчатки, в котором синаптические терминалы и синаптические контакты остаются в основном неповрежденными. Для оценки высвобождения использовались два дополнительных метода: методы измерения емкости и записи постсинаптического тока (PSC), вызванного пресинаптической стимуляцией во время одновременных парных записей. Кинетику высвобождения оценивали, варьируя длительность деполяризующего импульса, используемого для вызова высвобождения.Оба метода выявили наличие двух кинетических компонентов для высвобождения из палочек и колбочек, что позволяет предположить наличие двух различных пулов высвобождаемых везикул. Кроме того, быстрый компонент высвобождения из колбочек был в> 10 раз быстрее, чем из палочек. Хотя другие факторы также важны, быстрая кинетика высвобождения из колбочек может вносить вклад в быстрые ответы, вызванные конусами в биполярных и горизонтальных клетках.

Материалы и методы

Препараты. Эксперименты проводились на сетчатке водной тигровой саламандры ( Ambystoma tigrinum ; 18-25 см). Процедуры ухода и обращения были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского центра Университета Небраски. Животных умерщвляли декапитацией, из глаз удаляли ядра и удаляли переднюю часть глаза, включая хрусталик. Для подготовки срезов сетчатки полученный наглазник разрезали на четыре части, и срез наглазника помещали стекловидной стороной вниз на кусок фильтровальной бумаги (2 × 5 мм; тип AAWP; 0.Поры 8 мкм; Миллипор, Бедфорд, Массачусетс). После приклеивания к фильтровальной бумаге сетчатка была изолирована в холодном суперфузате амфибий. Срезы сетчатки (125 мкм) были вырезаны с помощью измельчителя тканей с бритвенным лезвием (Stoelting, Wood Dale, IL) и помещены в записывающую камеру, чтобы обеспечить возможность просмотра слоев сетчатки с помощью вертикального микроскопа с фиксированным предметным столиком [BHWI (Olympus, Токио, Япония) или E600 FN (Nikon, Токио, Япония)].

Для записи EPSC срезы суперфузии со скоростью ~ 1 мл / мин насыщенным кислородом раствором, содержащим следующее (в мм): 111 NaCl, 2.5 KCl, 1,8 CaCl ₂ , 0,5 MgCl ₂ , 10 HEPES, 5 глюкоза, 0,1 пикротоксина и 0,001 стрихнина, pH 7,8. Для регистрации изменения емкости суперфузат содержал следующее (в мм): 95 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl ₂ , 0,5 MgCl ₂ , 5 CsCl, 10 тетраэтиламмонийхлорид (TEACl), 10 HEPES, 5 глюкозы, и 0,2 нифлумовой кислоты, pH 7,8. Нифлуминовая кислота, TEACl и CsCl были включены для минимизации напряжения и проводимости, активированной Ca ²⁺ . Присутствие HEPES сводит к минимуму эффекты везикулярных протонов в синаптической щели (DeVries, 2001).Осмолярность проверяли с помощью осмометра давления пара (Wescor, Logan, UT) и, при необходимости, доводили до ~ 242 мОсм. Если не указано иное, химические вещества были получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури).

Выделенные палочки ферментативно диссоциировали папаином, как описано Thoreson et al. (2004) и помещали на предметные стекла, покрытые конканавалином А (1 мг / мл). Нифлуминовая кислота не добавлялась во время записи на изолированные клетки, потому что она ингибировала токи кальция ( I _Ca ) (Thoreson et al., 2003) и, таким образом, часто увеличивается блокируемая емкость, вызванная короткими шагами деполяризации. Как описано в разделе Результаты, хвостовые токи, вызванные длинными этапами деполяризации в отсутствие нифлуминовой кислоты, не оказали существенного влияния на измерения емкости, поскольку амплитуда и ход хвостовых токов не коррелировали с изменениями емкости, и испытания с модельной схемой ячейки показали, что большие изменения сопротивления мембраны, моделирующие большие хвостовые токи, не вызывают заметных изменений емкости.

Электрофизиология. Записи целых клеток с разорванным участком были получены с использованием патч-электродов 8-15 МОм, вытянутых из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,2 мм; внутренний диаметр 0,95 мм; с внутренней нитью; World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) на PP- Съемник для микропипеток 830 (Narishige USA, East Meadow, NY). Раствор пипетки содержал следующее (в мм): 48 Cs глюконат, 42 CsCl, 9,4 TEACl, 1,9 MgCl ₂ , 9,4 MgATP, 0,5 GTP, 0,5 EGTA и 32.9 HEPES, pH 7,2. При необходимости осмолярность доводили до ~ 242 мОсм. Для регистрации емкости пипетки были покрыты Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) для уменьшения паразитной емкости. Остаточная емкость пипетки компенсировалась электронным способом. Суперфузат удаляли отсасыванием, чтобы поддерживать постоянный объем ванны и тем самым предотвращать изменения паразитной емкости пипетки.

Измерения емкости были выполнены с использованием режима «track-in» усилителя Optopatch patch-clamp, в котором действительные и мнимые выходные сигналы синхронизированного усилителя обеспечивают отрицательную обратную связь с настройками управления сопротивлением и емкостью, а также синусоидальную волну 70 Гц. применяется для постоянной оптимизации настройки фазы.Подробное описание измерений емкости с использованием этого усилителя предоставлено Johnson et al. (2002). Удерживающий потенциал изменяли синусоидально (500-600 Гц; 30 мВ от пика до пика) примерно со средним удерживающим потенциалом -70 мВ. Коэффициент усиления обратной связи Track-in был увеличен до максимального стабильного значения (обычно 500-1000). Выходные данные усилителя мембранного тока, емкости мембраны и последовательного сопротивления были получены и проанализированы с помощью интерфейса Digidata 1200 и программного обеспечения pClamp 8.1 (Axon Instruments, Foster City, CA).(Выходная проводимость мембраны явно не обеспечивается усилителем с фазовой синхронизацией Optopatch.) Токи фильтровались в нижних частотах на 2 кГц, а изменения емкости на 100 Гц. Клетки стимулировали стадиями деполяризации до -10 мВ от среднего удерживающего потенциала -70 мВ. Сигналы синхронизации были стробированы во время шага и в течение 3 мс после него, чтобы избежать влияния стробирующих зарядов на измерения емкости. Изменения емкости измеряли через 25-50 мс после ступени, чтобы избежать выбросов, которые иногда могут быть вызваны схемой слежения за фазой с положительной обратной связью в течение первых 25 мс после ступени (Johnson et al., 2002). Как обсуждается далее в разделе «Результаты», в течение первых 25 мс наблюдался минимальный эндоцитоз.

В небольшом количестве экспериментов мы измерили емкость, используя протокол двойной синусоидальной волны, реализованный с помощью программного обеспечения jClamp (Scisoft, New Haven, CT). В этих экспериментах к удерживающему потенциалу постоянного тока применялся стимул напряжения (15 мВ от пика до пика) с частотой 390,6 и 781,2 Гц, а анализ проводимости проводился на основе быстрого преобразования Фурье отклика по току каждые 5,12 мс для получения оценок емкости мембраны. , последовательное сопротивление, сопротивление мембраны и ток мембраны.

При обоих подходах одинаковый шаг, применяемый через ~ 30 с, обычно дает одинаковый емкостной отклик, что позволяет проводить несколько измерений в каждой ячейке. Последовательность предъявления стимулов варьировалась от клетки к клетке, чтобы избежать возможных эффектов порядка. Отклик, вызванный этапом деполяризации 100 мс (от -70 до -10 мВ), периодически повторно тестировался, чтобы проверить, нет ли отклика.

Палочки и колбочки различались по положению и форме их клеточных тел, а также по характерным внешним сегментам, когда они присутствовали (Sherry et al., 1998; Стелла и Торесон, 2000). Пассивные свойства мембраны и сопротивление доступу оценивали с помощью функции тестирования мембран в Clampex (pClamp 8.1; Axon Instruments). Записи, в которых сопротивление доступа было> 50 МОм, были отклонены; сопротивление доступа среди оставшихся ячеек в среднем составляло 36,0 ± 1,3 МОм ( n = 51). Предварительные эксперименты не выявили очевидных различий в емкостных характеристиках ячеек с внешними сегментами или без них, за исключением большего емкостного шума среди ячеек с большей емкостью всей ячейки.Мы проводили большинство наших экспериментов на клетках с внешними сегментами, потому что они казались более здоровыми, чем клетки без внешних сегментов. Емкость стержней и конусов с внешними сегментами составляла в среднем 22,6 ± 1,1 пФ ( n = 29) и 46,5 ± 3,2 пФ ( n = 28) соответственно. Стержни и конусы без внешних сегментов показали общие значения емкости 11,5 ± 0,5 пФ ( n = 19) и 18,0 ± 1,8 пФ ( n = 7). Переходные процессы емкости, вызванные ступенями деполяризации в клетках с внешними сегментами, как правило, хорошо соответствовали одноэкспоненциальным функциям со средними постоянными времени 2.1 ± 0,1 и 2,8 ± 0,2 мс в стержнях ( n = 29) и колбочках ( n = 33) соответственно. Вывод о том, что стержни и колбочки кажутся изопотенциальными, согласуется с измерениями, выполненными Lasater et al. (1989), в котором они регистрировались одновременно с конечного и внутреннего сегментов шишек черепахи. Входное сопротивление ( R, _в ) стержней и конусов с приемлемыми токами удержания (<200 пА при -70 мВ) в среднем составляло 1,1 ± 0,1 ГОм и 960 ± 140 МОм соответственно. В соответствии с выводом Тейлора и Морганса (1998) о том, что входное сопротивление конуса не коррелировало с общей емкостью ячейки, не было статистически значимой разницы во входном сопротивлении фоторецепторных ячеек с сегментами или без них.

Для парных записей стержни или колбочки фиксировали напряжением одновременно с соседними постсинаптическими нейронами, используя усилитель с фиксатором Multiclamp (Axon Instruments). Обе записывающие пипетки были размещены с помощью микроманипуляторов Huxley-Wall (Sutter Instruments, Novato, CA). Токи регистрировали с использованием интерфейса Digidata 1322 и программного обеспечения pClamp 8.1 (Axon Instruments). Фоторецепторы были зафиксированы по напряжению на уровне -70 мВ, биполярные ячейки — на уровне -50 мВ, а горизонтальные ячейки — на уровне -40 мВ.Горизонтальные клетки демонстрируют внешние световые токи, внутренние токи, вызванные ступенями деполяризации, приложенными к пресинаптическим стержням, и большие внутренние выпрямляющие токи, зависящие от напряжения. Выключенные биполярные клетки также показывают направленные наружу световые токи и внутренние токи, вызванные пресинаптической деполяризацией, но обычно демонстрируют более высокое входное сопротивление и профиль тока-напряжения, в котором преобладают токи, выпрямляющие наружу. Включенные биполярные ячейки демонстрируют выпрямляющийся наружу профиль тока-напряжения, аналогичный выключенным биполярным ячейкам, но с направленными внутрь световыми токами.Идентичность пресинаптических и постсинаптических клеток подтверждали анатомически путем добавления флуоресцентного индикатора, Люцифер желтый (2 мг / мл), к раствору пипетки. Кривые зарядки биполярных клеток хорошо описываются одиночными экспонентами, что указывает на компактную электротонную структуру (Thoreson and Miller, 1996; Thoreson et al., 2004).

Критерий статистической значимости был выбран равным p <0,05 и оценен с помощью тестов F для сравнения различных аппроксимаций кривых или тестов Стьюдента t для сравнения различных образцов с использованием программного обеспечения GraphPad (Сан-Диего, Калифорния) Prism 4 .Вариабельность указывается как ± SEM.

Результаты

Чтобы сравнить синаптическую передачу от палочек и колбочек, мы записали одновременно от фоторецепторов и нейронов сетчатки второго порядка с использованием препарата среза сетчатки. Высвобождение глутамата из окончаний фоторецепторов стимулировали с помощью шагов деполяризации от -70 до -10 мВ, применяемых к палочкам или колбочкам. Чтобы проанализировать кинетику высвобождения, мы варьировали продолжительность пресинаптической деполяризации (стержни, 10-1000 мс; колбочки, 10-2000 мс), одновременно регистрируя EPSC от синаптически связанных OFF биполярных или горизонтальных клеток.Циклотиазид (0,1 мм) добавляли для блокирования десенсибилизации рецептора AMPA. В соответствии с предыдущими результатами, показывающими, что рецепторы глутамата в этих клетках являются прежде всего рецепторами типа AMPA (Maple et al., 1999), циклотиазид сделал EPSC менее преходящими в каждой горизонтальной или выключенной биполярной клетке, использованной для этого исследования.

Рисунок 1 показывает EPSC, вызванные в биполярной клетке OFF деполяризацией пресинаптического стержня (левый столбец) и EPSC в другой биполярной клетке OFF, стимулированные пресинаптическим конусом (правый столбец).Увеличение длительности шага более 10 мс не привело к заметному увеличению амплитуды EPSC ни ​​в биполярной ячейке с конусом, ни в выключенном стержневом элементе. Наиболее заметным изменением EPSC с увеличением длительности шага было небольшое расширение EPSC в биполярной ячейке OFF с приводом от стержня, когда длительность шага была увеличена с 10 до 100 мс (рис. 1 A ). Это расширение формы волны EPSC согласуется с высвобождением большего количества пузырьков с шагом 100 мс, чем с шагом 10 мс в стержнях.Меньшее изменение EPSC, вызванного конусом, наблюдаемое при тех же условиях, свидетельствует о меньшем увеличении количества пузырьков, высвобождаемых конусом. Как в стержневых, так и в конических ячейках, EPSC спадали в течение 100 мс, даже когда длительность шага была увеличена до 1000 мс. Обнаружение того, что EPSC распадался почти до исходного уровня в присутствии циклотиазида, предполагает, что временный характер исходного компонента не вызван десенсибилизацией рецептора глутамата. Распад EPSC может вместо этого отражать истощение высвобождаемых везикул после начального всплеска экзоцитоза.

Шаги деполяризации (от -70 до -10 мВ), примененные к палочкам или колбочкам, вызвали переходные ЭПСК в одновременно записанных ВЫКЛЮЧЕННЫХ биполярных клетках. Циклотиазид (0,1 мМ) добавляли для ингибирования десенсибилизации рецептора AMPA. A , EPSC, вызываемые шагами длительностью 10, 100 и 1000 мс. B , Наложение EPSC, вызванных шагами 100 мс в биполярных ячейках с приводом от стержня (тонкая кривая) и ведомым конусом (толстый график) OFF, показывает, что EPSC с коническим приводом демонстрируют более быстрое начало и смещение, чем EPSC с приводом от стержня.

EPSC, вызванные в клетках, управляемых колбочками, были более временными, чем в клетках, управляемых стержнями, даже в присутствии циклотиазида. Это различие можно увидеть на Рисунке 1 B , если наложить EPSC от биполярных ячеек с выключенными стержнями и конусами. Как начальный рост, так и последующее затухание EPSC были быстрее в биполярной ячейке с выключенным конусом (толстая кривая), чем в биполярной ячейке с выключенным стержнем (тонкая кривая). Для количественной оценки различий в кинетике EPSC среди клеток, управляемых стержнями и колбочками, каждое из начальных возрастаний и последующего распада EPSC, полученных в циклотиазиде, было сопоставлено с одноэкспоненциальной функцией.Ответы были включены в этот анализ, если временной ход мог адекватно соответствовать одной экспоненте. В биполярных и горизонтальных ячейках с коническим выключением, EPSC увеличивались и падали с постоянными времени, которые в среднем составляли 7,0 ± 2,0 мс ( n = 8) и 19,1 ± 2,6 мс ( n = 8), соответственно. В биполярных и горизонтальных ячейках с приводом от стержней, EPSCs увеличивались и падали значительно медленнее с постоянными времени 14,7 ± 2,3 мс ( n = 10; p = 0,009) и 120,3 ± 34.4 мс ( n = 12; p = 0,033) соответственно. Значительные различия палочка / колбочка также наблюдались, когда сравнения ограничивались биполярными клетками OFF [стержневой τ _на = 16,5 ± 2,8 мс ( n = 7) против τ _{на конусе на} = 2,4 ± 1,1 мс ( n = 4), p = 0,005; распад τ _{со стержневым управлением} = 63,6 ± 6,7 мс ( n = 9) по сравнению с затуханием τ _{с конусом} = 19,1 ± 3,4 мс ( n = 6), p = 0.0002].

Величину переноса заряда во время EPSC использовали как меру высвобождения глутамата. Как показано на рисунке 2, увеличение продолжительности этапа деполяризации вызвало первоначальный быстрый рост переноса заряда EPSC с последующим более медленным увеличением с более длинными этапами. Увеличение переноса заряда с увеличением длительности шага соответствовало биэкспоненциальной функции как в стержневых, так и в конических ячейках. Это двухфазное увеличение переноса заряда соответствует двум кинетически различным фазам высвобождения.

Есть две кинетические составляющие EPSC, вызванные ступенями деполяризации, применяемыми к стержням и колбочкам. Увеличение продолжительности (от 10 до 1000 мс) шагов деполяризации (от -70 до -10 мВ), применяемых к стержням или колбочкам, вызывало биэкспоненциальное увеличение переноса заряда EPSC, измеренного в выключенных биполярных и горизонтальных клетках во время парных записей срезов сетчатки. Данные для ячеек с приводом от стержня показаны в A , а данные для ячеек с коническим приводом показаны в B .Подходы к кратковременным шагам расширены в наборах. Постсинаптические записи были получены как от выключенных биполярных клеток (стержневые, n = 5; конические, n = 6), так и горизонтальные клетки (стержневые, n = 3; конические, n = 6) в присутствии циклотиазида (0,1 мм). Данные шести стержневых ячеек были использованы для аналогичного сравнения Thoreson et al. (2004). Не было обнаружено различий между отношениями ответ / продолжительность в биполярных и горизонтальных клетках OFF при синаптической стимуляции одним и тем же типом фоторецепторов.Перенос заряда во время EPSC был интегрирован и нормализован к переносу заряда, вызванному этапом деполяризации 500 мс. Данные были подобраны с помощью двухэкспоненциальных функций (стержни, τ ₁ = 27,5 мс, τ ₂ = 954 мс; конусы, τ ₁ = 2,4 мс, τ ₂ = 570 мс). Планки погрешностей представляют SEM.

Наиболее заметное различие между стержневыми и конусными ячейками на Рисунке 2 состоит в том, что начальная составляющая зависимости переноса заряда от продолжительности конусных ЭПС была в> 10 раз быстрее (τ ₁ = 2.4 мс), чем у стержневых ЭПН (τ ₁ = 28 мс). В отличие от различий в начальном компоненте высвобождения, как стержневые, так и конусообразные клетки показали одинаковые медленные компоненты (τ ₂ > 500 мс). Поскольку эти кинетические различия между EPSC, управляемыми стержнями и колбочками, наблюдались после расширения EPSC с помощью циклотиазида, они вряд ли отражают различия в десенсибилизации рецепторов глутамата в синапсах, управляемых стержнями и колбочками. Вместо этого более быстрый начальный компонент на графике ответ / продолжительность и более кратковременные EPSC в нейронах, управляемых конусами, с большей вероятностью объясняются начальным всплеском высвобождения из колбочек, которое в> 10 раз быстрее, чем всплеск высвобождения из стержней.Дополнительные доказательства этого представлены ниже.

Различия между стержнями и конусами в форме волны EPSC или кинетике высвобождения не отражают различия между стержнями и конусами в кинетике активации или инактивации I _Ca . В соответствии с Corey et al. (1984) мы обнаружили, что I _Ca активируется быстро (рис. 3) с биэкспоненциальным временным ходом, и константы времени активации существенно не различались ( p = 0,18 для сравнения значений τ ₁ ; р = 0.72 для сравнения значений τ ₂ ) между стержнями (τ ₁ = 0,78 ± 0,12 мс; τ ₂ = 2,53 ± 0,38 мс) и конусами (τ ₁ = 0,97 ± 0,06 мс; τ ₂ = 2,37 ± 0,25 мс). Хотя I _Ca быстро активируется, он очень медленно инактивируется (Corey et al., 1984; Wilkinson and Barnes, 1996) с постоянной времени в стержнях ~ 1,7 с (Rabl and Thoreson, 2002). Несмотря на то, что I _Ca демонстрировал минимальную инактивацию в течение первых 100 мс стадии деполяризации как в палочках, так и в колбочках (рис.3), за тот же период времени EPSC распадались почти до базовой линии (рис. 1). Это согласуется с выводами Singer и Diamond (2003) в ленточном синапсе от палочковых биполярных клеток до амакриновых клеток AII, показывающих, что временные EPSC в биполярных и горизонтальных клетках могут быть вызваны устойчивым поступлением кальция в стержневые и конусные окончания.

Деполяризация мембраны вызвала экзоцитоз палочек и колбочек в срезе сетчатки. Кривые показывают ток мембраны ( I _м ), емкость мембраны ( C _м ), сопротивление доступа ( R _a ) и протокол воздействия.Емкость контролировалась в стержне ( A ) и конусе ( B ) с помощью усилителя фазовой синхронизации при синусоидальном изменении удерживающего потенциала (600 Гц, ± 15 мВ) относительно среднего удерживающего потенциала — 70 мВ. Фазовое отслеживание стробировалось во время шага теста деполяризации до -10 мВ (100 мс) и в течение 3 мс после шага. Пассивные сопротивления мембраны 500 МОм в стержне и 800 МОм в конусе были вычтены из трассы тока.

Чтобы проверить, возникают ли различия в кинетике EPSC из-за различий в скорости экзоцитоза на концах стержней и конусов, мы использовали методы записи емкости для непосредственного измерения высвобождения.Емкость мембраны контролировали путем синусоидальной модуляции (± 15 мВ) мембранного потенциала около среднего удерживающего потенциала -70 мВ с использованием усилителя с фазовой синхронизацией, интегрированного в усилитель с коммутационным зажимом. Экзоцитоз стимулировали этапами деполяризации переменной продолжительности (10-2000 мс) до -10 или -30 мВ. Измерение емкости было приостановлено на этапе тестирования. Как показано на Фигуре 3, внутрь I _Ca , стимулированное стадией деполяризации (200 мс), вызывалось экзоцитотическое увеличение емкости мембраны как в палочковидных, так и в колбочковых клетках.Когда мониторинг емкости был возобновлен после этапа испытания, емкость мембраны увеличилась на 240 фФ в стержне и на 300 фФ в конусе. Предполагая, что емкость одного пузырька составляет 57 aF (Thoreson et al., 2004), это увеличение емкости отражает слияние 4210 и 5260 пузырьков, соответственно. Емкость мембраны обычно начинала восстанавливаться в течение нескольких сотен миллисекунд после этапа испытания. Время, необходимое для восстановления емкости на 50% после шага испытания 500 мс, в среднем составляло 350 мс для конусов и> 500 мс для стержней.(Более точная оценка для стержней недоступна, потому что некоторые клетки не достигли 50% восстановления до конца 1,5-секундного испытания.)

Ряд различных наблюдений показывает, что наблюдаемые изменения емкости отражают истинные изменения емкости мембраны. Вызванное деполяризацией увеличение емкости не было результатом изменений сопротивления доступа, поскольку оно оставалось неизменным в этих экспериментах (рис. 3, 4). Достаточно большие изменения сопротивления мембраны также могут вызывать артефактические изменения емкости (Joshi and Fernandez, 1988; Gillis, 1995).Чтобы свести к минимуму изменения проводимости, мы подавили хвостовые токи, возникающие в результате активации хлоридных токов, активируемых кальцием, путем применения нифлумовой кислоты (0,2 мм). Хотя нифлумовая кислота блокировала большую часть этого тока, иногда наблюдались остаточные хвостовые токи с более длинными шагами. При шаге 2 с хвостовые токи в стержнях составляли в среднем 79 ± 12 пА ( n = 12), а в конусах — 20 ± 7 пА ( n = 10). Почти полная блокировка хвостовых токов в колбочках согласуется с эффективностью нифлумовой кислоты в колбочках, показанной Barnes and Deschenes (1992).Постоянная времени для инактивации хвостового тока увеличивается как функция продолжительности; увеличение постоянных времени инактивации показало постоянную времени 1,05 с в стержнях и 0,48 с в конусах, что указывает на то, что остаточные токи хвоста часто все еще присутствовали во время измерения емкости. Однако наличие остаточных хвостовых токов не оказало существенного влияния на измерения емкости. Вызванные деполяризацией изменения емкости наблюдались в клетках с небольшим хвостовым током или без него (рис.3), и наоборот, в контрольных экспериментах, исключающих нифлуминовую кислоту из среды купания, хвостовые токи могли быть вызваны без сопутствующих изменений емкости (рис. 4). Кроме того, изменение емкости во времени не отражало изменения тока в хвосте (рис. 4). Используя другой подход, мы смоделировали эффекты большого хвостового тока, который может наблюдаться в отсутствие нифлумовой кислоты, с использованием модельной схемы, которая имитировала пассивные мембранные свойства конуса. Уменьшение сопротивления мембраны в этой цепи с 800 до 500 МОм практически не привело к изменению емкости (рис.4). Наконец, как описано ниже (см. Рис. 6, 7), наблюдалось тесное согласие между увеличением емкости и измерениями переноса заряда EPSC, обеспечивающими дополнительную проверку увеличения емкости в качестве меры экзоцитоза.

Хвостовые токи могут быть вызваны без изменения измерений емкости. A , Небольшое изменение емкости или его отсутствие наблюдалось, когда сопротивление мембраны в модельной конической ячейке было вручную уменьшено с 800 до 500 МОм для имитации большого изменения проводимости, сопровождающего хвостовой ток.Емкость контролировали с использованием функции отслеживания фазы усилителя Optopatch, как описано в разделе «Материалы и методы». B , Пример стержневого фоторецептора, показывающий, что хвостовые токи могут быть вызваны в ячейках без сопутствующих изменений емкости. В этом эксперименте нифлумовая кислота не добавлялась, чтобы обеспечить генерацию хвостовых токов. В начале записи с этого стержня шаг теста деполяризации (200 мс, от -70 до -10 мВ) вызывал входящий хвостовой ток в конце шага (вверху слева) и большое увеличение емкости (внизу слева).Применение того же шага испытания через 15 минут вызывало аналогичные входящие внутрь хвостовые токи (вверху справа), но без увеличения емкости (внизу справа).

Есть два кинетических компонента экзоцитоза от палочек ( A ) и колбочек ( B ). Увеличения емкости, вызванные деполяризацией, были нанесены на график как функция длительности шага. Отношения емкости / продолжительности соответствовали двойным экспоненциальным функциям.Подгонки к кратковременным шагам раскрыты на вставках. Стержни, τ ₁ = 46 мс, Амплитуда ₁ (A ₁ ) = 132 фФ, τ ₂ = 14 с, Амплитуда ₂ (A ₂ ) = 1170 фФ; конусов, τ ₁ = 2,7 мс, A ₁ = 306 фФ, τ ₂ = 1,4 с, A ₂ = 474 фФ. Размеры выборки: стержни, 10 мс, n = 9; 25 мс, n = 11; 50 мс, n = 10; 100 мс, n = 12; 200 мс, n = 11; 500 мс, n = 10; 1000 мс, n = 10; 2000 мс, n = 7; конусы, 3 мс, n = 9; 5 мс, n = 5; 10 мс, n = 16; 25 мс, n = 14; 50 мс, n = 13; 100 мс, n = 20; 200 мс, n = 12; 500 мс, n = 11; 1000 мс, n = 11; 2000 мс, n = 12.Планки погрешностей представляют SEM.

Емкость ( C _м ) изменения, вызванные в стержнях ( A ) или конусах ( B ) за счет шагов деполяризации (от -70 до -10 мВ) различной продолжительности (3-1000 мс в стержни, 3-2000 мс в конусах) линейно коррелируют с интегральным переносом заряда ЭПСК в биполярных и горизонтальных ячейках OFF (стержни, r ² = 0,95; колбочки, r ² = 0.91). Планки погрешностей представляют SEM.

Увеличение длительности этапа деполяризации увеличивало амплитуду вызванного увеличения емкости мембраны. На рисунке 5 A показано увеличение емкости, вызванное в стержне ступенями деполяризации до -10 мВ за 10 мс (30 фФ), 100 мс (80 фФ) и 1000 мс (110 фФ). На рисунке 5 B показано увеличение емкости, вызванное в конусе шагами деполяризации 10 мс (170 фФ), 100 мс (430 фФ) и 1000 мс (570 фФ). На рис. 6 показано, как увеличивается емкость в зависимости от продолжительности шага для всего образца стержней и конусов.В соответствии с результатами парных записей (рис. 2), а также предыдущими результатами для изолированных стержней (Thoreson et al., 2004) и других ленточных синапсов (Parsons et al., 1994; von Gersdorff and Matthews, 1994a), емкость / отношения продолжительности в палочках и колбочках соответствовали двойным экспоненциальным функциям, предполагая, что существует две кинетически различных фазы экзоцитоза. Считается, что начальный быстрый компонент отражает быстрое высвобождение пула пузырьков, которые предназначены для высвобождения, и медленный компонент, продолжающий тоническое высвобождение пузырьков (Lenzi and von Gersdorff, 2001).

Увеличение длительности шага деполяризации увеличивало скачок емкости как в стержнях, так и в конусах. Верхние кривые показывают увеличение емкости ( C _м ), вызванное стержнем ( A ) и конусом ( B ) с шагом деполяризации 10, 100 и 1000 мс (от -70 до — 10 мВ). Никаких значительных изменений сопротивления доступа (средние дорожки; R _a ), связанных со ступенями напряжения (нижние дорожки), не наблюдалось.

Как было обнаружено в экспериментах EPSC, начальный быстрый компонент высвобождения был в> 10 раз быстрее в колбочках (τ ₁ = 3 мс), чем в стержнях (τ ₁ = 46 мс). Амплитуда быстрого компонента в колбочках (306 фФ) соответствует высвобождению 5370 везикул. Это было примерно вдвое больше, чем быстрый компонент в стержнях (132 fF), что соответствует высвобождению 2300 везикул или чуть меньше половины везикул, привязанных к лентам в пресинаптическом окончании (4970 везикул) (Thoreson et al. ., 2004). Первоначальная постоянная времени, полученная из измерений выброса EPSC, была быстрее, чем найденная с использованием данных емкости. Это различие является результатом интеграции переноса заряда по всей EPSC и, таким образом, подсчета пузырьков в течение немного более длительного временного окна, чем в экспериментах с емкостью. За счет ограничения периода интегрирования продолжительностью шага испытания начальная постоянная времени вплотную приблизилась к значениям, найденным в экспериментах с емкостным сопротивлением.

И в стержнях, и в колбочках также присутствовал компонент с медленным замедленным высвобождением с постоянной времени, превышающей 1 с.Со временем этот медленный компонент внес существенный вклад в высвобождение: к концу 2-секундного этапа тестирования высвободилось примерно в два раза больше везикул, чем было высвобождено начальным быстрым компонентом (стержни, 298 ± 58 fF или 5228 пузырьков; колбочки, 656 ± 53 фФ или 11500 пузырьков). Это следует рассматривать как оценку нижней границы общего числа высвобожденных везикул, поскольку эндоцитоз мог снизить амплитуду емкостных ответов, вызванных более длинными шагами (≥500 мс).

Мы исследовали, сохраняются ли кинетические различия палочки / колбочки при стимуляции клеток с шагом от -70 до -30 мВ, близким к физиологическому диапазону напряжения.Как и в случае шагов до -10 мВ, показанных на рисунке 6, есть две кинетические составляющие увеличения емкости в зависимости от продолжительности шага. Увеличение емкости хорошо соответствовало биэкспоненциальным функциям с использованием постоянных времени 20 и 640 мс в стержнях ( n = 6-13 для каждой точки) и 3 и 230 мс в конусах ( n = 8-13 для каждой точки; данные не показано). Хотя наиболее подходящий начальный компонент для высвобождения из стержней, вызванный шагами до -30 мВ, был несколько быстрее, чем тот, который был получен с шагами до -10 мВ, разница не была значительной и оставалась почти в 10 раз быстрее, чем исходный компонент в колбочках.Это предполагает, что значительные кинетические различия в высвобождении из палочек и колбочек, вероятно, сохранятся в диапазоне физиологического напряжения.

Чтобы проверить потенциальный вклад соединения стержень-стержень в срезе сетчатки земноводных в измеренную кинетику высвобождения из стержней, мы повторили измерения емкости / продолжительности (10-1000 мс) на ферментативно изолированных стержнях с интактными синаптическими окончаниями. Емкость увеличивалась с биэкспоненциальной зависимостью от времени в изолированных стержнях, которая не сильно отличалась от той, которая была обнаружена в стержнях из среза (t ₁ = 87 мс, t ₂ = 4.5 с, n = 9; сравнение обоих компонентов, р = 0,78; сравнение только значений τ ₁ , p = 0,49).

В предыдущем исследовании мы обнаружили биэкспоненциальный рост высвобождения из изолированных стержней в зависимости от длительности этапа деполяризации, но начальный компонент высвобождения был намного быстрее, чем обнаруженный в настоящем исследовании (τ ₁ = 6 мс) ( Thoreson et al., 2004). Описанные выше данные предполагают, что разница не была результатом использования изолированных клеток.Различия также не связаны с использованием программного протокола двойной синусоидальной волны для измерения емкости, потому что мы повторили измерения на стержнях в срезе, используя метод двойной синусоидальной волны (jClamp; Scisoft) и получили постоянные времени для выпуска, которые были незначительно отличается от тех, которые были обнаружены с помощью схемы отслеживания фазы Optopatch (τ ₁ = 100 мс, τ ₂ > 10 с, n = 6-8 на точку данных; сравнение обоих компонентов, p = 0 .72; сравнение только значений τ ₁ , p = 0,76). Вместо этого различия, по-видимому, объясняются тем фактом, что в предыдущем исследовании изменения емкости измерялись в течение 10 мс сразу после ступени, тогда как в текущем исследовании изменения емкости измерялись через 25-50 мс после ступени. Когда данные Thoreson et al. (2004) были повторно проанализированы путем измерения изменений емкости через 25-50 мс после шага, мы получили значения емкости на ∼40 фФ меньше, чем полученные ранее, и эти значения дали более медленную начальную постоянную времени, что хорошо согласуется с данными настоящего исследования ( τ ₁ = 21 мс; τ ₂ = 436 с).

Чтобы лучше сравнить емкость и измерения экзоцитоза EPSC, мы построили график переноса заряда EPSC в зависимости от изменения емкости, вызванного шагами той же продолжительности (рис. 7). Значения переноса заряда были нормированы на перенос заряда, вызванный шагом 500 мс. Две меры высвобождения сильно коррелировали как в стержнях ( r ² = 0,95), так и в колбочках ( r ² = 0,91). Увеличение емкости и перенос заряда PSC, вызванный ступенями до -30 мВ в стержнях, также тесно коррелировали ( r ² = 0.87; данные не показаны). Тесная корреляция между этими сходящимися измерениями экзоцитоза подтверждает открытие, что существуют значительные различия в кинетике высвобождения из стержней и конусов конуса.

Обсуждение

Результаты этого исследования показывают, что есть две кинетически различные фазы высвобождения везикулярного глутамата из синаптических окончаний палочек и колбочек, и что начальная фаза высвобождения протекает в колбочках гораздо быстрее, чем в палочках.Практически идентичные результаты были получены при использовании двух конвергентных методов измерения высвобождения. В парных экспериментах по регистрации целых клеток, в которых вызванный деполяризацией EPSC в выключенных биполярных и горизонтальных клетках использовался в качестве индекса для высвобождения, было обнаружено, что начальный компонент высвобождения из колбочек был в> 10 раз быстрее, чем начальный компонент высвобождения. из прутьев. Аналогичным образом, увеличение емкости мембраны, что обеспечивает более прямое измерение экзоцитоза, показало, что быстрый компонент высвобождения из колбочек увеличивался с постоянной времени 3 мс, тогда как быстрый компонент высвобождения из стержней увеличивался с постоянной времени 46 мс.Считается, что быстрый начальный компонент высвобождения представляет собой высвобождение пула синаптических везикул, который подготовлен к высвобождению (Mennerick and Matthews, 1996; von Gersdorff et al., 1996; Moser and Beutner, 2000; Thoreson et al., 2004) . Обнаружение того, что колбочки демонстрируют более быстрый начальный кинетический компонент для высвобождения, указывает на то, что пузырьки в этом легко высвобождаемом пуле высвобождаются из колбочек быстрее, чем аналогичный пул пузырьков в палочках.

В предыдущем исследовании изолированных стержней Thoreson et al.(2004) также обнаружили биэкспоненциальный рост высвобождения в зависимости от продолжительности шага. Однако постоянная времени для начального компонента выброса (τ ₁ = 6 мс) была намного быстрее, чем в настоящем исследовании. Наши результаты показали, что более быстрая кинетика, обнаруженная ранее, не может быть объяснена отсутствием связи в изолированных стержнях или использованием методов измерения емкости двойной синусоидальной волны. Однако повторный анализ данных Thoreson et al. (2004) путем измерения увеличения емкости на 25-50 мс после ступени, а не в течение первых 10 мс после ступени, как это было сделано ранее, мы получили меньшее увеличение емкости, что привело к более медленной начальной постоянной времени для высвобождения (τ ₁ = 21 мс), что хорошо согласуется с настоящими данными.Наблюдение за тем, что изменения емкости, измеренные в течение первых 10 мс после ступени, были на ~ 40 фФ больше, чем изменения емкости, измеренные через 25-50 мс после ступени, предполагает, что имело место кратковременное увеличение емкости, которое уменьшилось в течение 25 мс. Такое кратковременное увеличение емкости могло быть вызвано экзоцитозом типа «поцелуй и беги», но обнаружение того факта, что рост PSC как функция продолжительности тесно связан с увеличением емкости, измеренной через 25-50 мс после ступени, предполагает, что дополнительная емкость увеличение, наблюдаемое в течение первых 10 мс, имело незначительный постсинаптический эффект и поэтому, вероятно, не связано с синаптической передачей (например,g., отражающий внесинаптический экзоцитоз или невезикулярный артефакт).

Сопутствующий эндоцитоз может приводить к чистому снижению увеличения экзоцитотической емкости. Постоянная времени для эндоцитоза в стержнях была оценена в ~ 700 мс (Rieke and Schwartz, 1996), что согласуется с нашим выводом о том, что для восстановления 50% требуется> 500 мс. Обнаружена хорошая линейная корреляция между амплитудой увеличения емкости, вызванной деполяризацией, и переносом заряда во время EPSC, который пересекает начало координат в стержнях (рис.7), предполагая, что эндоцитоз минимален во время этапов теста продолжительностью до 1 секунды, возможно, потому, что эндоцитоз может быть ингибирован во время этапа теста повышенными уровнями Ca ²⁺ , как это обнаружено в биполярных клетках сетчатки (von Gersdorff and Matthews, 1994b ). Эндоцитоз мембраны протекал несколько быстрее в колбочках, достигая 50% восстановления после ~ 350 мс и, следовательно, мог уменьшить размер увеличения емкости, вызванного ступенями ≥500 мс в колбочках (рис. 6). Уменьшение емкостных характеристик с длинными шагами объяснило бы наблюдение, что линейная корреляция между емкостью и показателями высвобождения PSC в конусах, в отличие от стержней, пересекает ординату выше 0 фФ (рис.7). Хотя эндоцитоз мог снизить амплитуду увеличения емкости, вызванного длительными этапами деполяризации, особенно в колбочках, эндоцитоз, по-видимому, не оказал значительного влияния на измерения, сделанные в течение первых нескольких сотен миллисекунд, и, таким образом, вряд ли повлиял на определение кинетики начального быстрого компонента. выпуска. Кроме того, схожая кинетика высвобождения в терминалах палочек и конусов была обнаружена с использованием измерений высвобождения PSC, которые нечувствительны к эндоцитозу.

Хотя исчерпывающее определение механизмов, ответственных за более быструю кинетику высвобождения в колбочках по сравнению со стержнями, выходит за рамки настоящего исследования, мы можем исключить ряд возможностей: (1) Более быстрая кинетика высвобождения, измеренная в колбочках, вряд ли будет артефактом. возникающие из-за различий в свойствах пассивных мембран, потому что постоянные времени мембраны для колбочек были медленнее, а не быстрее, чем у стержней (2,8 против 2,1 мс). (2) Обнаружение того, что кинетика высвобождения из изолированных палочек была аналогична кинетике высвобождения из палочек из препарата среза сетчатки, указывает на то, что медленная кинетика высвобождения из палочек также не является следствием обширного сцепления палочек в сетчатке амфибий.(3) Было показано, что кинетика высвобождения на терминалах биполярных клеток ограничивается кинетикой активации I _Ca (Mennerick and Matthews, 1996). Наблюдение за тем, что скорость активации I _Ca (τ ₁ , ∼1 мс; τ ₂ , ∼2,5 мс) аналогична активации начального компонента экзоцитоза в колбочках (τ ₁ , ~ 3 мс) согласуется с возможностью того, что скорости активации I _Ca могут ограничивать кинетику высвобождения на концах конуса.Однако постоянная времени 46 мс для активации начального компонента экзоцитоза в стержнях существенно ниже, чем скорость активации I _Ca , что позволяет предположить, что другие факторы ограничивают кинетику высвобождения из стержней. (4) I _Ca инактивируется с аналогичной медленной кинетикой как в палочках, так и в колбочках, что указывает на то, что переходные EPSC не отражают быструю инактивацию I _Ca (рис. и Thoreson, 2002).Другие оставшиеся возможности, которые могут объяснить кинетические различия между палочками и колбочками, включают различия в свойствах экзоцитотических белков (Wang et al., 2003), диффузионное расстояние между кальциевыми каналами и сайтами высвобождения, а также внутриклеточное управление кальцием в терминалах палочков и колбочек (Krizaj et al. ., 2003).

формирует постсинаптические ответы (Diamond and Jahr, 1995; Isaacson and Walmsley, 1995), и быстрое высвобождение пузырьков из колбочек аналогичным образом может способствовать более быстрому начальному росту EPSC в клетках, управляемых колбочками, по сравнению с палочковидными клетками. -приводимые элементы (рис.1). Подобно стержневому биполярному ленточному синапсу на амакриновые клетки AII (Singer and Diamond, 2003), EPSC распадался почти до исходного уровня, несмотря на продолжающийся приток кальция пресинаптически и блокировку постсинаптической десенсибилизации рецептора AMPA циклотиазидом. Таким образом, снижение EPSC легче объяснить истощением пула высвобождаемых пузырьков. Более того, поскольку колбочки первоначально высвобождают свои везикулы быстрее, чем палочки, легко высвобождаемый пул пузырьков также должен истощаться быстрее в колбочках, чем в палочках.Более быстрое истощение пузырьков на концах колбочек может объяснить более быстрое снижение EPSC, наблюдаемое в клетках, управляемых колбочками, по сравнению с клетками, управляемыми палочками (Fig. 1). Различия в свойствах рецепторов глутамата также могут способствовать формированию кинетики EPSC (DeVries, 2000), хотя недавние исследования в нашей лаборатории не выявили серьезных фармакологических различий в рецепторах глутамата, с которыми связываются палочки и колбочки (наши неопубликованные наблюдения).

Влияние кинетики высвобождения на форму PSC, вызванных этапами деполяризации от -70 мВ, относительно очевидно по сравнению с их влиянием на вызванные светом ответы.Вызванные светом изменения в синаптическом выходе сочетают пополнение везикул и снижение экзоцитоза, которые сопровождают гиперполяризацию в начале света, с повышенной скоростью экзоцитоза, вызванного деполяризацией при смещении света. Полный анализ влияния этих различных факторов на кинетические различия вызванных светом ответов еще не был проведен, но настоящие результаты, показывающие различия палочки / колбочки в начальном быстром компоненте с использованием этапов тестирования вблизи темнового потенциала, предполагают, что различия в скорость экзоцитоза может влиять на синаптический выход в ответ на вызванные светом изменения мембранного потенциала.Из-за быстрого истощения пузырьков, которое обязательно сопровождает быстрое высвобождение, маловероятно, что чрезвычайно быстрое высвобождение из колбочек может поддерживаться очень долго. Таким образом, когда фоторецептор поддерживается на деполяризованном потенциале в физиологических условиях, медленные, устойчивые компоненты высвобождения, вероятно, будут становиться все более важными. Однако лежащая в основе способность колбочек быстро высвобождать везикулы может позволить кратковременное, но существенное усиление экзоцитоза, когда колбочки деполяризуются в ответ на снижение интенсивности света.Кратковременное увеличение синаптического выхода будет способствовать более быстрому синаптическому импульсному отклику колбочек по сравнению со стержнями (Schnapf and Copenhagen, 1982; Copenhagen et al., 1983).

Сноски

• Эта работа была поддержана Национальным институтом глаз (EY-10542), Фондом Гиффорда, Lion’s Clubs, Fight for Sight и Research to Preventness. Мы благодарим Эрика Брайсона за его техническую помощь и Рут Хайдельбергер за ее комментарии к этой рукописи.

• Для корреспонденции Уоллес Б.Thoreson, отделение офтальмологии, Медицинский центр Университета Небраски, Исследовательский центр Дарема, Омаха, NE 68198-5840. Электронная почта: WBTHORES {at} UNMC.EDU.

• Copyright © 2005 Society for Neuroscience 0270-6474 / 05 / 254633-08 $ 15.00 / 0

Ссылки

1. ↵

   Barnes S, Deschenes MC (1992) Вклад Ca и Ca-активированных Cl-каналов в регенеративную деполяризацию и бистабильность мембран фоторецепторов колбочек. J Neurophysiol 68: 745-755.

2. ↵

   Baylor DA, Fettiplace R (1977) Передача от фоторецепторов к ганглиозным клеткам сетчатки черепахи. J. Physiol (Лондон) 271: 391-448.

3. ↵

   Бейлор Д.А., Ходжкин А.Л. (1973) Обнаружение и разрешение зрительных стимулов фоторецепторами черепах. J. Physiol (Lond) 234: 163-198.

4. ↵

   Copenhagen DR, Ashmore JF, Schnapf JK (1983) Кинетика синаптической передачи от фоторецепторов к горизонтальным и биполярным клеткам сетчатки черепахи.Видение Res 23: 363-369.

5. ↵

   Кори Д.П., Дубинский Ю.М., Шварц Е.А. (1984) Кальциевый ток во внутренних сегментах палочек сетчатки саламандры ( Ambystoma tigrinum ). J. Physiol (Лондон) 354: 557-575.

6. ↵

   DeVries SH (2000) Биполярные клетки используют каинатные и AMPA рецепторы для фильтрации визуальной информации в отдельные каналы. Нейрон 28: 847-856.

7. ↵

   DeVries SH (2001) Экзоцитозированная обратная связь протонов для подавления тока Ca ²⁺ в фоторецепторах колбочек млекопитающих.Нейрон 32: 1107-1117.

8. ↵

   Diamond JS, Jahr CE (1995) Асинхронное высвобождение синаптических везикул определяет временной ход EPSC, опосредованного рецептором AMPA. Нейрон 15: 1097-1107.

9. ↵

   Гиллис К.Д. (1995) Методы измерения емкости мембран. В: Одноканальная запись, Эд 2 (Сакманн Б., Нехер Э., ред.), Стр. 155-198. Нью-Йорк: Пленум.

10. ↵

    Isaacson JS, Walmsley B (1995) Подсчет квантов: прямые измерения высвобождения передатчика в центральном синапсе.Нейрон 15: 875-884.

11. ↵

    Johnson SL, Thomas MV, Kros CJ (2002) Измерение емкости мембраны с помощью патч-зажима со встроенным самобалансирующимся синхронным усилителем. Pflügers Arch 443: 653-663.

12. ↵

    Joshi C, Fernandez JM (1988) Измерения емкости: анализ техники фазового детектора, используемой для изучения экзоцитоза и эндоцитоза. Biophys J 53: 885-892.

13. ↵

    Коренброт Дж. И., Ребрик Т. И. (2002) Настройка гомеостаза внешнего сегмента Ca ²⁺ на фототрансдукцию в палочках и колбочках.Adv Exp Med Biol 514: 179-203.

14. ↵

    Krizaj D, Lai FA, Copenhagen DR (2003) Запасы рианодина и регуляция кальция во внутренних сегментах палочек и колбочек саламандр. J. Physiol (Лондон) 547: 761-774.

15. ↵

    Lasater EM, Normann RA, Kolb H (1989) Интеграция сигналов на ножке фоторецепторов конуса черепахи: анатомическое и электрофизиологическое исследование. Vis Neurosci 2: 553-564.

16. ↵

    Lenzi D, von Gersdorff H (2001) Структура предполагает функцию: случай синаптических лент как экзоцитотических наномашин.BioEssays 23: 831-840.

17. ↵

    Maple BR, Gao F, Wu SM (1999) Рецепторы глутамата различаются в нецентральных биполярных клетках с доминированием палочков и колбочек. NeuroReport 10: 3605-3610.

18. ↵

    Mennerick S, Matthews G (1996) Сверхбыстрый экзоцитоз, вызванный током кальция в синаптических окончаниях биполярных нейронов сетчатки. Нейрон 17: 1241-1249.

19. ↵

    Moser T, Beutner D (2000) Кинетика экзоцитоза и эндоцитоза в афферентном синапсе внутренних волосковых клеток улитки мыши.Proc Natl Acad Sci USA 97: 883-888.

20. ↵

    Парсонс Т.Д., Лензи Д., Алмерс В., Робертс В.М. (1994) Экзоцитоз и эндоцитоз, запускаемый кальцием в изолированной пресинаптической клетке: измерения емкости в мешковидных волосковых клетках. Нейрон 13: 875-883.

21. ↵

    Пасино Э., Маркиафава П.Л. (1976) Передаточные свойства палочко-колбочковых клеток в сетчатке тигровой саламандры. Видение Res 16: 381-386.

22. ↵

    Rabl K, Thoreson WB (2002) Кальций-зависимая инактивация и истощение синаптической щели ионами кальция в сочетании регулируют токи кальция стержня в физиологических условиях.Eur J Neurosci 16: 2070-2077.

23. ↵

    Rieke F, Schwartz E (1996) Асинхронное высвобождение передатчика: контроль экзоцитоза и эндоцитоза в синапсе стержня саламандры. J. Physiol (Лондон) 493: 1-8.

24. ↵

    Schmitz Y, Witkovsky P (1997) Зависимость высвобождения глутамата фоторецептора от дигидропиридин-чувствительного кальциевого канала. Неврология 78: 1209-1216.

25. ↵

    Schnapf JL, Copenhagen DR (1982) Различия в кинетике синаптической передачи палочки и конуса.Природа 296: 862-864.

26. ↵

    Шерри Д.М., Буй Д.Д., Дегрип В.Дж. (1998) Идентификация и распределение подтипов фоторецепторов в неотенической сетчатке тигровой саламандры. Vis Neurosci 15: 1175-1187.

27. ↵

    Singer JH, Diamond JS (2003) Устойчивое поступление Ca ²⁺ вызывает переходные постсинаптические токи в ленточном синапсе сетчатки. J. Neurosci 23: 10923-10933.

28. ↵

    Stella Jr SL, Thoreson WB (2000) Дифференциальная модуляция кальциевых токов палочек и колбочек в сетчатке тигровой саламандры с помощью рецепторов дофамина D2 и цАМФ.Eur J Neurosci 12: 3537-3548.

29. ↵

    Taylor WR, Morgans C (1998) Локализация и свойства потенциалзависимых кальциевых каналов в колбочковых фоторецепторах Tupaia belangeri . Vis Neurosci 15: 541-552.

30. ↵

    Thoreson WB, Miller RF (1996) Удаление внеклеточного хлорида подавляет высвобождение передатчика из окончаний фоторецепторов в сетчатке грязной щенки. J Gen Physiol 107: 631-642.

31. ↵

    Thoreson WB, Nitzan R, Miller RF (1997) Снижение внеклеточного Cl ^— подавляет дигидропиридин-чувствительные токи Ca ²⁺ и синаптическую передачу в фоторецепторах амфибий.J Neurophysiol 77: 2175-2190.

32. ↵

    Thoreson WB, Bryson EJ, Rabl K (2003) Взаимные взаимодействия между кальцием и хлоридом в стержневых фоторецепторах. J Neurophysiol 90: 1747-1753.

33. ↵

    Thoreson WB, Rabl K, Townes-Anderson E, Heidelberger R (2004) Пул везикул с высокой чувствительностью к Ca ²⁺ способствует линейности в ленточном синапсе стержневых фоторецепторов. Нейрон 42: 595-605.

34. ↵

    von Gersdorff H, Matthews G (1994a) Динамика слияния синаптических пузырьков и извлечения мембран в синаптических окончаниях.Nature 367: 735-739.

35. ↵

    von Gersdorff H, Matthews G (1994b) Ингибирование эндоцитоза повышенным внутренним кальцием в синаптическом окончании. Nature 370: 652-655.

36. ↵

    von Gersdorff H, Vardi E, Matthews G, Sterling P (1996) Доказательства того, что везикулы на синаптической ленте биполярных нейронов сетчатки могут быстро высвобождаться. Нейрон 16: 1221-1227.

37. ↵

    Wang CT, Lu JC, Bai J, Chang PY, Martin TF, Chapman ER, Jackson MB (2003) Различные домены синаптотагмина контролируют выбор между поцелуем и бегом и полным слиянием.Nature 424: 943-947.

38. ↵

    Wilkinson MF, Barnes S (1996) Подтип дигидропиридин-чувствительных кальциевых каналов в фоторецепторах колбочек. J Gen Physiol 107: 621-630.

39. ↵

    Витковский П., Стоун С. (1983) Входы стержней и колбочек в биполярные и горизонтальные клетки сетчатки Xenopus . Видение Res 23: 1251-1258.

Как и почему клетки растут как палочки | BMC Biology

Границы | цГМФ в палочках мышей: пространственно-временная динамика, лежащая в основе однофотонных ответов

Обзор фототрансдукции стержней

Преобразование световой энергии в электрические сигналы в палочках и колбочках фоторецепторных клеток сетчатки — это первый шаг в развитии зрения. Когда фоторецепторы умирают, как при таких заболеваниях, как пигментный ретинит или возрастная дегенерация желтого пятна, в остальном неповрежденная зрительная система теряет свой нормальный вход, и зрение теряется.Фундаментальные свойства палочек и колбочек, включая эффективность захвата фотонов, усиление, кинетику и спектральную чувствительность, сильно ограничивают информацию, передаваемую остальной зрительной системе и, в конечном итоге, воспринимаются как яркость, форма, цвет, движение и т. Д.

Ночное видение в почти 1000-кратном диапазоне освещенности от звездного света до полной луны работает на диете, буквально голодной по фотонам (Burns and Pugh, 2014). Все аспекты зрения в таких ночных условиях регулируются исключительно сигналами, исходящими от стержней, которые генерируют высоконадежные изменения мембранного тока в ответ на поглощение одиночных фотонов (Baylor et al., 1979b) Эти однофотонные ответы (SPR) управляются цепочкой биохимических реакций («фототрансдукция»), которые преобразуют поглощение фотонов в изменения внутриклеточной концентрации цГМФ, которая, воздействуя на цГМФ-чувствительные ионные каналы, обеспечивает эту исключительную чувствительность. зажечь.

Белки и сигнальные пути, лежащие в основе фототрансдукции палочек, высоко консервативны у позвоночных, и у многих видов задействованные ключевые белки поддаются эффективной биохимической очистке и анализу in vitro .За десятилетия биохимической работы мы много знаем об идентичности, стехиометрии, связывающих взаимодействиях и даже структуре большинства белков, необходимых для передачи сигналов. Например, мы знаем, что фотон соответствующей энергии возбуждает рецептор, связанный с G-белком, родопсин, который, в свою очередь, активирует многие копии трансдуцина G-белка (Gα _t β ₁ γ ₁ ). Каждый активированный Gα _t стехиометрически активирует цГМФ фосфодиэстеразу (ФДЭ6), что приводит к падению концентрации цГМФ.Это падение цГМФ вызывает закрытие циклических нуклеотид-управляемых (CNG) каналов на плазматической мембране, что приводит к снижению входящего катионного тока (и уровней свободного внутриклеточного Ca ²⁺ ) и, в конечном итоге, к гиперполяризации мембраны, которая снижает синаптическое высвобождение глутамат. Своевременное восстановление тока требует синтеза цГМФ гуанилатциклазами и дезактивации молекул родопсина и G-белка / PDE.

Скорость многих из этих шагов может быть исследована физиологически на неповрежденных стержнях с помощью записи с помощью отсасывающего электрода (Baylor et al., 1979a), где ферменты и субстраты присутствуют в их естественных концентрациях, а ток через мембрану отражает концентрацию цГМФ с точностью до миллисекунды. Благодаря широкой доступности генетически модифицированных белков фототрансдукции (Fu and Yau, 2007; Burns and Pugh, 2010) палочки мыши стали особенно ценным препаратом для исследования пространственно-временной динамики передачи сигналов cGMP.

Структурные и биохимические ограничения на передачу сигналов Cgmp в стержнях

Пространственное распространение сигналов cGMP ограничено внутриклеточными дисками

Характер стека дисков

Фототрансдукция происходит внутри специализированного цилиндрического субклеточного отсека, внешнего сегмента, который предназначен исключительно для поглощения и преобразования фотонов (Рис. 1A).Внешний сегмент заполнен плотным слоем богатых белком липидных мембран, называемых дисками (рис. 1B). На дисках находятся ассоциированные с мембраной ферменты каскада, включая родопсин, трансдуцин, фосфодиэстеразу (PDE), гуанилатциклазу, а также регуляторные белки, такие как родопсинкиназа (GRK1) и комплекс RGS9 (ниже). Обилие родопсина в дисковых мембранах (25 000–30 000 мкм, ^–2 ) и большое количество плотно уложенных друг на друга дисков (30 мкм ^–1 ) создают высокое осевое поглощение, гарантируя захват большой доли падающих фотонов. .Плотность трансдуцина и PDE достаточна для обеспечения высокой скорости диффузионного столкновения, что позволяет передавать одиночный фотон быстро и сильно усиливаться (Pugh and Lamb, 1993).

РИСУНОК 1. Генерация пространственно-временной динамики цГМФ каскадом фототрансдукции палочек сетчатки. (A) Схема палочкообразного фоторецептора, выделяющая отделение светочувствительного внешнего сегмента (скобка), содержащее стопки внутриклеточных мембранных дисков и гипотетическое поглощение фотонов (зеленая звездочка), происходящее в середине длины внешнего сегмента ( x _или ). (B) Первичные ферменты, ответственные за генерацию динамики цГМФ, расположены на мембранах внутриклеточных дисков, отделенных от цГМФ-чувствительного канала (CNG) и Na ⁺ / Ca ²⁺ , расположен обменник K ⁺ на плазматической мембране. Поглощение фотона (зеленая звездочка) молекулой родопсина (Rh) активирует несколько G-белков (G) и цГМФ-фосфодиэстеразы (PDE), которые не могут продольно диффундировать внутри стержня из-за их тесной связи с мембраной диска.Фактически, активация PDE вызывает снижение уровня цитоплазматического цГМФ вдоль продольной оси стержня. Уровень цГМФ восстанавливается за счет активности гуанилатциклазы (GC). (C) Падение цГМФ [относительно уровня темноты, (цГМФ) _D ] как функция расстояния от места поглощения фотона ( x _o , зеленая звездочка) может быть либо мелким, либо широкая (фиолетовая пунктирная кривая) или глубокая и узкая (пунктирная синяя кривая) с заметно разными последствиями для воспроизводимости и линейности сигнала (см. текст).

В то время как первичные ферменты каскада — фотовозбужденный родопсин (R ^* ) и активированный трансдуцином PDE (E ^* ) — ограничены поверхностью мембраны диска, где был захвачен фотон, вторые мессенджеры cGMP и Ca ^{2 +} являются цитозольными и могут диффундировать как радиально, так и аксиально во внешний сегмент. Цитозольная диффузия в палочках уравновешивается гораздо быстрее в радиальном направлении, чем в осевом или продольном измерении (Lamb et al., 1981; Olson and Pugh, 1993).Как следствие, диффузия цГМФ в стержне может характеризоваться эффективным продольным коэффициентом диффузии ( D _cG ). Поскольку диски занимают более 95% поперечного сечения внешнего сегмента, они задерживают осевую диффузию в 20 или более раз ниже ее значения в свободном цитозоле (Lamb et al., 1981; Cameron and Pugh, 1990; Olson and Pugh , 1993; Холькман, Коренброт, 2004). Независимо от того, является ли падение цГМФ относительно мелким, но пространственно широко распространенным или глубоким и пространственно ограниченным (рис. 1C), фундаментально влияет на передачу сигналов палочки, включая степень, в которой колебания биохимических процессов вызывают электрические колебания, и диапазон, в котором палочки могут линейно суммировать одновременно поглощенные фотоны.Этот вопрос неоднократно рассматривался экспериментально и теоретически, и результаты кратко изложены ниже.

Различия в ультраструктуре приводят к тому, что D _cG изменяется у стержней разных видов. Наружные сегменты жаб и саламандр имеют гораздо больший диаметр (6-15 мкм), чем у их собратьев-млекопитающих (1-2 мкм). Кроме того, стержневые диски имеют узкие радиальные зазоры, называемые «надрезами», которые имеют тенденцию выравниваться в осевом направлении (Cohen, 1963) и значительно облегчают продольную диффузию.Длина и количество надрезов варьируются у разных видов, от 1 у мышей и людей до 18 или более у стержней тигровой саламандры (Olson and Pugh, 1993).

Оценки D _cG были сделаны на основе оптических измерений диффузии флуоресцентных соединений, включая флуоресцеин-цГМФ (Olson and Pugh, 1993; Holcman and Korenbrot, 2004), а также электрических измерений тока, активируемого цГМФ в диализованные стержни (Cameron and Pugh, 1990; Koutalos et al., 1995a, c; Wu et al., 2006). Для стержней наибольшего диаметра (саламандра) D _cG оказалось равным 5–10 мкм ² s ^-1 (Cameron and Pugh, 1990; Olson and Pugh, 1993), а для узких стержней мышей , ∼40 мкм ² с ^-1 (Holcman, Korenbrot, 2004; Gross et al., 2012b). D _cG , однако, является только одним из нескольких факторов, управляющих пространственным профилем истощения cGMP во время SPR, как мы сейчас обсудим.

Пространственная протяженность и глубина локального истощения цГМФ во время однофотонного отклика

Прямое измерение осевого распространения цГМФ или Ca ²⁺ во время SPR является сложной задачей, потому что большая часть света, используемого для визуализации, сильно активирует фототрансдукцию.Как следствие, измерения, основанные на анализе электрофизиологических данных, предоставили основную массу доказательств. Хотя такие измерения являются косвенными, они упрощаются из-за отсутствия зависимости от напряжения каналов стержневого цГМФ и отсутствия других значительных токов внешнего сегмента. Один экспериментальный подход включает использование щелей или небольших пятен для доставки световых стимулов в различные места внешнего сегмента при регистрации мембранного тока. Такие эксперименты дали противоречивые результаты, при этом некоторые авторы пришли к выводу, что во время SPR цГМФ лишь незначительно падает от своего уровня покоя на большой пространственной протяженности (Hemilä and Reuter, 1981; Field and Rieke, 2002), в то время как другие пришли к выводу, что изменение очень велико. локализованные (Lamb et al., 1981; Gray-Keller et al., 1999). Расхождения между экспериментами можно было ожидать, потому что они проводились на палочках разных видов с различной морфологией внешнего сегмента и коэффициентами диффузии цГМФ (см. Выше).

Стационарная мера пространственного распространения передачи сигналов цГМФ в палочках мыши

Недавнее исследование (Gross et al., 2012b) определило пространственное распространение сигнала cGMP, инициированного естественными очень долгоживущими «мошенническими» R ^* , которые производят SPR ступенчатой ​​формы (Baylor и другие., 1984). Для таких SPR пространственный профиль цГМФ находится в стабильном состоянии. Концентрация цГМФ снижается в зависимости от расстояния от «точки приема» активности ФДЭ и предсказывается простым аналитическим выражением:

cG (x) cGdark = 1 − e− | x − x0 | / λ1 + C⁢ (1)

Здесь cG ( x ) представляет концентрацию цГМФ в осевом положении x вдоль внешнего сегмента _, cG _dark равномерная концентрация в стержне в темноте, x ₀ местоположение поглощения фотонов, λ = λ = DcG / βdark — пространственная постоянная профиля cGMP, а C — постоянная, которая зависит от известных параметров геометрии стержня и измеренного времени жизни E ^∗ .Параметр β _dark представляет собой константу скорости спонтанного гидролиза цГМФ во внешнем сегменте в темноте, определенную как 4,1 с ^-1 для палочек мыши (Gross et al., 2012b). Это математическое описание пространственного профиля цГМФ может быть преобразовано в ожидаемое изменение тока внешнего сегмента путем замены хорошо установленной взаимосвязи между цГМФ и стробированием канала (см. Уравнения 2 и 3 ниже) в уравнение. 1, и выполняя пространственное интегрирование по длине внешнего сегмента.Gross et al. (2012b) определили λ и C из экспериментально измеренных стационарных амплитуд ложного ППР, получив λ = 3,1 мкм для пространственной постоянной и [1 / (1+ C )] = 0,61 для глубины снижения цГМФ при x ₀ . Из того же анализа, D _cG был оценен как 40 мкм ² s ^-1 , что очень близко к значению 36 мкм ² s ^-1 , оцененному для стержней грызунов Holcman и Korenbrot ( 2004) исключительно из геометрических соображений.Хотя этот анализ пространственного профиля цГМФ во время SPR был основан на стационарных амплитудах SPR, вызванных «мошенническими» родопсинами, анализ обеспечивает строгую нижнюю границу глубины профиля цГМФ и верхнюю границу пространственной протяженности. . Он также обеспечивает разумные и последовательные оценки D _cG и совокупного усиления трансдукции (Leskov et al., 2000; Heck and Hofmann, 2001). Наиболее важно то, что результирующие значения параметров β _dark и D _cG в целом действительны и необходимы для ограничения пространственно-временной модели, которая включает в себя нормальные времена жизни R ^∗ и E ^∗ , а также как эффекты регуляции кальциевой обратной связи на синтез цГМФ, как обсуждается в следующих разделах.

PDE способствует усилению SPR, но также ускоряет передачу сигналов и ограничивает ее надежность

R ^∗ обычно активен в течение короткого времени (∼40 мс; Gross and Burns, 2010). Однако в течение своего короткого времени жизни R ^∗ активирует трансдуцины (G _t ) с высокой скоростью, ∼350 с ^-1 на R ^∗ в палочках млекопитающих при температуре тела (Heck and Hofmann, 2001). В свою очередь, каждый G _t активирует PDE, в результате чего на пике SPR активны ∼10 E ^∗ (Gross et al., 2012б). Несмотря на это небольшое количество E ^* , значительное изменение концентрации цГМФ обеспечивается, поскольку E ^* действует на цГМФ в относительно небольшом объеме междискового пространства, и каждый E ^* является высокоэффективным ферментом. Таким образом, каталитическая эффективность ПДЭ составляет k _cat / K _m = 4,4 × 10 ⁸ M ^-1 s ^-1 (Лесков и др., 2000), что близко к предел скорости (∼10 ⁹ M ^-1 с ^-1 ), установленный диффузией цГМФ к каталитическому сайту PDE (Reingruber et al., 2013).

Активность фосфодиэстеразы влияет на передачу сигналов другими способами, особенно в палочке, адаптированной к темноте, потому что молекулы PDE иногда становятся спонтанно активными. Во-первых, эта спонтанная или базальная «темная» активность устанавливает порог, который должен быть преодолен активированной светом PDE-активностью, генерируемой одним R ^* . Во-вторых, величина, обратная базовой скорости гидролиза PDE (1 / β _dark ), соответствует среднему времени жизни молекулы цГМФ в темноте и способствует скорости восстановления SPR (Никонов и др., 2000; Гросс и др., 2012b; Reingruber et al., 2013). В-третьих, скорость базального гидролиза определяет пространственную постоянную пространственного профиля цГМФ (см. Выше. Уравнение 1). В-четвертых, спонтанная активность PDE вызывает значительные колебания мембранного тока, называемые «непрерывным шумом» (Baylor et al., 1980; Rieke and Baylor, 1996), который изменяется в зависимости от плотности мембраны PDE таким образом, который может компенсировать различия. по диаметру наружного сегмента (Reingruber et al., 2013).

Падение cGMP достаточно невелико, чтобы максимизировать выигрыш, полученный от совместного стробирования каналов

Свойства канала КПГ

Светостимулируемая активность PDE снижает концентрацию цГМФ в цитоплазме, что приводит к закрытию каналов, управляемых цГМФ (CNG) в плазматической мембране, и уменьшению переносимого ими внутреннего тока.Стержневой канал CNG представляет собой гетеротетрамер, состоящий из трех α- и одной β-субъединицы (Shuart et al., 2011), и проницаем для Na ⁺ , K ⁺ и Ca ²⁺ (Craven and Zagotta, 2006 г.). Α-субъединица канала связывается с обменником Na ⁺ / Ca ²⁺ -K ⁺ в плазматической мембране (Schwarzer et al., 2000) через белковые домены, богатые глутаминовой кислотой (GARP), вероятно, способствуя пространственно-временной динамике внутреннего кальция. Цитозольные белки GARP (GARP-1 и GARP-2) также имеют фундаментальное значение в сборке структуры внешнего сегмента и стабилизации краев дисков (Korschen et al., 1999; Poetsch et al., 2001; Риттер и др., 2011).

Проводимость каналов CNG уравновешивается концентрацией цГМФ в течение миллисекунд (Cobbs, Pugh, 1987; Karpen et al., 1988), так что временной ход SPR не ограничивается временем отклика канала, а скорее отслеживает изменение локальной концентрации цГМФ. Концентрация цГМФ в темноте составляет 3-4 мкМ, что является низким по сравнению с K _1/2 (∼20 мкМ) каналов, так что большинство каналов CNG закрыты даже в полной темноте.Эти особенности канала, а также его относительная нечувствительность к напряжению в физиологическом диапазоне мембранных потенциалов (Bodoia and Detwiler, 1985; Baylor and Nunn, 1986) позволили исследовать биохимию фототрансдукции через электрический отклик. Стробирование канала КПГ с помощью цГМФ является кооперативным, как это зафиксировано в соотношении Хилла, которое описывает зависимость от цГМФ тока КПГ в участке мембраны внешнего сегмента:

JcGJmax = cGncGn + K1 / 2n⁢ (2)

, где J, — текущая, cG, — концентрация цГМФ, n, — коэффициент Хилла и K _1/2, — концентрация полунасыщения.Ранние оценки коэффициента Хилла для канала варьировались от 1 до 3 (например, Fesenko et al., 1985; Haynes et al., 1986). Однако Ruiz et al. (1999) показали, что более низкие коэффициенты Хилла, вероятно, связаны с неоднородностью чувствительности к цГМФ ( K _1/2 ) в популяции каналов в любом данном участке. Эта неоднородность приводит к более пологой кривой зависимости реакции от дозы, что приводит к недооценке истинного коэффициента Хилла. В одноканальных экспериментах коэффициент Хилла постоянно измерялся равным трем, и сейчас это значение широко признано.

Вклад кооперативного стробирования в выигрыш

В живом стержне cG << K _{l / 2} и так из уравнения. 2 плотность тока в канале CNG J _cG (x) в любой точке x вдоль внешнего сегмента удовлетворяет

JcG (x) Jdark = [cG (x) cGdark] n⁢ (3)

, где J _dark — осевая плотность тока в темноте. Таким образом, вклад кооперативного стробирования канала цГМФ в усиление фототрансдукции определяется степенью падения локального уровня цГМФ во время SPR.Если частичное снижение цГМФ составляет менее примерно 20%, изменение тока будет усилено в три раза по сравнению с фракционным изменением концентрации цГМФ. С другой стороны, если локальное фракционное снижение цГМФ превышает ~ 20%, пропорциональность между амплитудой ответа и общим снижением цГМФ будет меньше трех, что фактически вызовет «насыщение» локального сигнала, опосредованного цГМФ. Вопрос о том, способствует ли местное насыщение снижению вариабельности SPR от испытания к испытанию, был решен в экспериментах на жабе (Rieke and Baylor, 1998), морских свинках и палочках обезьян (Field and Rieke, 2002), которые пришли к выводу, что полное локальное закрытие каналов не является основным фактором, ограничивающим изменчивость.У мышей локальное падение цГМФ на пике SPR обычно составляет менее 15% от темновой концентрации (Gross et al., 2012b), в первую очередь из-за быстрого увеличения синтеза цГМФ, который мы сейчас описываем.

Кальциевая обратная связь с синтезом цГМФ

Баланс между синтезом и гидролизом цГМФ

В темноте существует баланс между синтезом и гидролизом цГМФ, что приводит к стабильному уровню цГМФ (цГ _темный в уравнении 3). При скорости синтеза, обозначенной как α _dark , и константе скорости гидролиза как β _dark (см. Выше), стабильная концентрация цГМФ в темноте должна удовлетворять

cGdark = αdark / βdark⁢ (4)

Базальная скорость синтеза цГМФ, по оценкам биохимических анализов, составляет от 9 до 24 мкМ с ^-1 в адаптированных к темноте наружных сегментах палочек мыши (Makino et al., 2008). Учитывая β _dark = 4,1 с ^-1 (Gross et al., 2012b), скорость синтеза 9 мкМ с ^-1 соответствует cG _dark = 2,4 мкМ, а скорость синтеза 24 мкМ с ^-1 соответствует 6,6 мкМ. Первая из этих величин близка к оценке (3,2 мкМ), полученной в экспериментах с удочками саламандры (Cameron, Pugh, 1990).

Активация гуанилатциклазы снижением содержания кальция

Активация родопсина светом регулирует равновесный уровень цГМФ, стимулируя не только гидролиз цГМФ, но также синтез в сложной обратной связи с участием Са ²⁺ .В темноте около 15% входящего тока через каналы CNG переносится Ca ²⁺ , который гомеостатически откачивается через обменник Na / Ca-K (NCKX): закрытие каналов быстро вызывает внутренний Ca ²⁺ будет снижаться по мере уменьшения его притока и продолжения экструзии биржей NCKX. После световой стимуляции восстановление до адаптированного к темноте состояния требует не только дезактивации R ^* и E ^* , но также восстановления темновой концентрации цГМФ, который синтезируется из GTP гуанилатциклазой 1 и 2 сетчатки (RetGC). -1 и RetGC-2, «GC»; обзор см. В Sharma, 2010).Скорость синтеза цГМФ сильно зависит от внутриклеточной концентрации кальция (Koch and Stryer, 1988; Koutalos et al., 1995b). Эта кальциевая зависимость обеспечивается белками, активирующими гуанилатциклазу (GCAP-1 и GCAP-2), которые ингибируются связыванием кальция (Palczewski et al., 1994; Dizhoor and Hurley, 1996, 1999; Ames et al., 1999), но растормаживается по мере снижения содержания кальция во время световой реакции.

Кальциевая зависимость активации циклазы GCAP подчиняется соотношению Хилла с коэффициентом Хилла ∼2 и эффективным K _1/2 между 60 и 130 нМ (Dizhoor and Hurley, 1996; Ames et al., 1999; Palczewski et al., 2000; Макино и др., 2008; Пещенко и др., 2011). Механически чувствительность к кальцию обеспечивается тремя функциональными EF-руками, в то время как четвертая EF-рука не связывает кальций. В адаптированном к темноте внешнем сегменте, когда Ca ²⁺ находится на самом высоком уровне, сайты связывания металлов заняты кальцием, и GCAP ингибируются от активации GC. Поскольку Ca ²⁺ падает во время светового ответа, эти сайты связывания вместо этого становятся занятыми Mg ²⁺ , что облегчает активацию GC (Peshenko and Dizhoor, 2004).Свойства сенсора Ca ²⁺ / Mg ²⁺ демонстрируют немного разные чувствительности к GCAP-1 и GCAP-2, вероятно, способствуя их различному влиянию на световой отклик (Dizhoor et al., 2010).

Активация циклазы в живых палочках

Временной ход, с которым Ca ²⁺ снижается при закрытии каналов, зависит от скорости и K _1/2 Na ⁺ / Ca ²⁺ -K ⁺ обменника (NCKX ), объем внешнего сегмента, буферная способность кальция и коэффициент диффузии (Lagnado et al., 1992). В больших стержнях амфибий уменьшение кальция, оцененное по току обмена, имеет основную постоянную времени ~ 2 с (Cobbs, Pugh, 1987; Hodgkin et al., 1987), тогда как в небольших стержнях млекопитающих снижение более чем в 10 раз быстрее (Макино и др., 2004). Измерения концентрации кальция внешнего сегмента в темноте у палочек разных видов варьируются от 250 нМ (мышь, Woodruff et al., 2002) до 273 нМ (toad, Korenbrot and Miller, 1989), до 670 нМ. (саламандра, Сампат и др., 1998).

Сильная активация циклазы происходит даже во время SPR, ограничивая ее амплитуду и ускоряя ее восстановление: у палочек мышей, лишенных активации циклазы по кальциевой обратной связи (GCAPs ^{— / —} ), SPR имеет примерно в три-четыре раза большую амплитуду, чем у WT. стержней, достигая максимальной амплитуды и восстанавливаясь гораздо медленнее (рис. 2A; Mendez et al., 2001; Burns et al., 2002). В то время как повышенная амплитуда SPR стержней GCAP ^{— / —} является результатом в первую очередь отсутствия кальциевой обратной связи с циклазой, замедленное восстановление определяется постоянной времени обмена цГМФ (1 / β _темный = 245 мс), что становится этапом восстановления, ограничивающим скорость (см. выше; Никонов и др., 2000; Gross et al., 2012b).

РИСУНОК 2. Задержанный, нарастающий синтез цГМФ способствует временной точности и воспроизводимой амплитуде SPR. (A) Измеренные (сплошные) и смоделированные (пунктирные) SPR для стержней WT (серый) и GCAP ^{— / —} (зеленый; без кальциевой обратной связи), первоначально опубликованные в Gross et al. (2012b). (B) Пространственно интегрированные скорости гидролиза цГМФ (синяя кривая) и синтеза (красный) во время WT SPR, как вычислено с помощью пространственно-временной модели, соответствующей кривой WT в (A) .Скорость гидролиза цГМФ быстро выходит на плато, в то время как скорость синтеза цГМФ демонстрирует короткую задержку, за которой следует более медленный, нарастающий подъем до максимума. Толстые пунктирные линии показывают совпадающие фазы плато и нарастания гидролиза и синтеза соответственно. (C) Разница между скоростями синтеза и гидролиза цГМФ для стержней WT и GCAP ^{— / —} . Скорость синтеза цГМФ в стержнях GCAP ^{— / —} остается постоянной (не показано) из-за отсутствия кальциевой обратной связи.Обратите внимание, что переход через ноль трасс в (C) соответствует пикам SPR в (A) . Вертикальная пунктирная линия показывает время пика WT SPR на всех панелях.

Выводы из пространственно-временной модели Cgmp и Ca

Значение математических моделей отклика одиночного фотона

Математические модели могут внести большой вклад в понимание клеточной динамики, компактно воплощая современные молекулярные знания, давая количественное представление о ключевых биологических функциях, таких как усиление и надежность сигнала, а также предоставляя объяснения сбоев при заболеваниях или состояниях с молекулярной манипуляцией (например,г., Boyett et al., 2000; Тао и др., 2011). Модели фототрансдукции внесли вклад, например, в понимание молекулярных механизмов усиления светового ответа (Pugh and Lamb, 1993). В течение многих лет было понятно и общепринято, что весь временной ход светового отклика стержня должен быть описан в терминах пары связанных дифференциальных уравнений в частных производных, управляющих цитоплазматическим цГМФ и Ca ²⁺ с начальными и граничными условиями, а также с подходящая кинетическая модель активации и инактивации R ^* и E ^* (Lamb and Pugh, 1992; Andreucci et al., 2003). SPR был важной целью этого моделирования, и, возможно, никакая особенность SPR не была более известной и более сложной для понимания с молекулярной точки зрения, чем его стереотипная амплитуда: в частности, измеренный коэффициент вариации амплитуды (SD / среднее ) составляет 0,2–0,4 (Baylor et al., 1979b; Rieke, Baylor, 1998; Whitlock, Lamb, 1999; Field, Rieke, 2002; Hamer et al., 2003; Gross et al., 2012a), что намного ниже, чем это (1.0), которое произошло бы, если бы один лежащий в его основе R ^* деактивировался за один стохастический шаг.Для решения этой проблемы было опубликовано несколько моделей SPR (Rieke and Baylor, 1998; Field and Rieke, 2002; Hamer et al., 2003), включая несколько пространственно-временных моделей, то есть моделей, которые включают диффузию цГМФ и Ca ^{. 2+} (например, Andreucci et al., 2003; Bisegna et al., 2008; Reingruber, Holcman, 2008; Caruso et al., 2010, 2011; Gross et al., 2012a; Reingruber et al., 2013). В следующих параграфах мы суммируем некоторые новые результаты, которые были получены в результате разработки и применения «полностью ограниченной» пространственно-временной модели фототрансдукции к SPR палочек мышей со специфическими молекулярными возмущениями в аппарате фототрансдукции (Gross et al., 2012a, b), включая новое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе его стереотипной амплитуды. Во-первых, мы формулируем принципы, кратко объясняя, что подразумевается под «полностью ограниченным».

Обоснование модели в биохимических и биофизических измерениях и ограничениях

Учитывая, что решения основных уравнений могут быть получены, которые адекватно соответствуют фотоответам стержня, критический вопрос, который необходимо решить, прежде чем можно будет сделать достоверные выводы, — это «Являются ли параметры модели хорошо ограниченными?» Плохо ограниченные модели, даже если они точно описывают аспекты данных, могут привести к неоднозначным и даже ложным выводам.Таким образом, каждое потенциальное ограничение от структуры, биохимии и эксперимента, независимо от процесса подбора, должно быть включено так, чтобы в идеале не было действительно «свободных параметров», то есть параметров, значения которых определяются исключительно путем подбора.

Как описано выше, ключевой пространственный параметр D _cG , параметр скорости β _dark и совокупное усиление трансдукции были определены из независимых измерений (Gross et al., 2012b). in situ времени жизни усилителей трансдукции (R ^* и E ^* ) были включены из предыдущих электрофизиологических измерений ярких мгновенных ответов у мышей с генетической целью (Krispel et al., 2006; Gross and Burns, 2010), а кинетические параметры, относящиеся к Ca ²⁺ -зависимой активации NCKX и GCAP, были взяты непосредственно из биохимических исследований. Уровни темновой и максимальной активации циклазы определяли в результате экспериментов и анализа независимо от формы SPR. Среднее время жизни in situ амплифицирующих ферментов R ^* и активного комплекса PDE (E ^* ) определяли из независимых измерений по ярким вспышкам ответов генетически нацеленных мышей.

Палочки мышей с молекулярной мишенью обеспечивают множество индивидуальных ограничений на параметры модели. Одно из наиболее важных таких ограничений исходило от стержней без GCAP: отсутствие GCAP полностью устраняет кальциевую обратную связь с GC и, таким образом, отделяет параметры, управляющие кальциевой динамикой, от остальных уравнений фототрансдукции. Требование, чтобы модель SPR WT использовала в точности те же параметры, которые использовались для описания SPR GCAP ^{— / —} , является весьма ограничивающим и информативным (Gross et al., 2012b), так как значения только нескольких параметров, участвующих в потоках кальция и буферизации, затем могут быть ограничены биохимически определенными пределами, а затем оптимизированы процессом подбора.

Синтез цГМФ, активированный с помощью кальциевой обратной связи, обеспечивает временную точность и стабильность амплитуды для SPR

В нескольких исследованиях ранее был сделан вывод, что кальциевая обратная связь с синтезом цГМФ не играет роли в воспроизводимости SPR (Rieke and Baylor, 1998; Whitlock and Lamb, 1999), но этот вывод оказался несовместимым с работой, показывающей, что воспроизводимость разлагается в стержнях GCAP ^{— / —} (Gross et al., 2012а). Исследование лежащей в основе динамики цГМФ с использованием пространственно-временной модели показало, что задержка активации циклазы по сравнению с гидролизом цГМФ играет критическую роль. В начале SPR (рис. 2A) скорость гидролиза цГМФ под действием света быстро увеличивается (рис. 2В; синий), после чего она начинает выходить на плато, поскольку Ca ²⁺ неуклонно снижается, а скорость кальций-чувствительного цГМФ синтез поднимается по пандусу (рис. 2В; красный). Крутизна линейного изменения синтеза примерно пропорциональна плато скорости гидролиза, так что линейное изменение достигает плато гидролиза почти одновременно, почти независимо от времени жизни R ^* (Gross et al., 2012а). Это равновесие между гидролизом и синтезом цГМФ соответствует чистой скорости изменения цГМФ, равной нулю (рис. 2С) и, следовательно, пику SPR. Таким образом, отсроченная, нарастающая активация циклазы по кальциевой обратной связи придает инвариантность времени до пика SPR у мышей с измененным временем жизни R ^* и E ^* и, как следствие, их амплитудам SPR.

Кальциевая обратная связь существенно способствует воспроизводимости SPR

Давно выдвигалась гипотеза, что поздние этапы биохимически выполнимой деактивации R ^* могут значительно снизить надежность SPR «на поздних временах», и что единственным возможным объяснением наблюдаемой высокой надежности будет большое количество небольших этапов дезактивации (Rieke и Бейлор, 1998).Однако более поздняя работа показала, что широкое распределение времен жизни R ^* («шумный» родопсин) можно преодолеть с помощью кальциевой обратной связи и генерировать воспроизводимые SPR. Сам механизм, объясняющий «стабильность амплитуды» SPR для разных генотипов, также объясняет, почему стадии дезактивации R ^* на поздних стадиях не снижают воспроизводимость SPR: в частности, когда активность R ^* продлевается из-за стохастической дезактивации, задерживается кальций. обратная связь с циклазой нарастает, чтобы преодолеть длительную активность, стабилизируя время и амплитуду пика SPR WT.Кроме того, моделирование показывает, что из-за низкочастотной фильтрации активности R ^* путем медленной деактивации E ^* , колебания в течение короткого срока службы R ^* (∼40 мс) могут составлять полная степень изменчивости «поздней стадии», наблюдаемая за пределами пика SPR (> 130 мс; Gross et al., 2012a).

Мембранный поток превосходит внутриклеточную диффузию для внутриклеточной динамики кальция

Для палочек мышей с нормальной обратной связью Ca ²⁺ с циклазой теоретические расчеты показывают, что пространственная степень падения концентрации кальция в значительной степени отражает таковую для цГМФ (рис. 3А).Интересно, что это сходство пространственных профилей в значительной степени не зависит от значения коэффициента осевой диффузии кальция ( D _Ca ) во всем диапазоне (0,1–10 мкм ² s ^-1 ) физиологически приемлемых значений. при относительно сильном внутриклеточном буферизации кальция (рис. 3В). В то время как максимальная глубина снижения содержания кальция слегка изменяется при изменении D _Ca , амплитуда и временной ход моделируемой реакции тока внешнего сегмента не изменяются.Профиль кальция нечувствителен к D _Ca , потому что локальный чистый поток Ca ²⁺ через каналы CNG и NCKX, который зависит от градиента концентрации кальция через клеточную мембрану, намного больше, чем можно достичь. посредством пассивной диффузии при относительно небольшом градиенте внутриклеточной концентрации. В первом приближении величина обменного тока сопоставима с величиной компонента Ca ²⁺ тока канала CNG после короткой задержки (Lagnado et al., 1992). Поскольку ток канала CNG определяется исключительно концентрацией цГМФ, концентрация кальция также определяется концентрацией цГМФ (рис. 3С). Таким образом, диффузионные барьеры, присутствующие во внешнем сегменте, напрямую влияют только на пространственно-временную динамику цГМФ, а пространственно-временная динамика цГМФ определяют распределение кальция во время светового ответа. По-видимому, система обратной связи кальция обеспечивает форму самоограничения для внутриклеточного распространения сигнала второго мессенджера, внося вклад в линейность ответа за счет ограничения перекрытия сигнальных доменов, происходящих из множественных изомеризаций родопсина.

РИСУНОК 3. Обратная связь Ca ²⁺ с синтезом цГМФ ограничивает распространение сигналов вторичного мессенджера. (A) Расчетные пространственные профили снижения цГМФ во время пика WT (125 мс; серый) и GCAP ^{— / —} (320 мс; зеленый) SPR для R ^* , расположенного в середине стержень (x = 11 мкм). (B) Падение внутриклеточного Ca ²⁺ в значительной степени определяется потоком через каналы CNG и, следовательно, нечувствительно к значению коэффициента диффузии в диапазоне 0.1 (красный) — 10 (синий) мкм ² с ^-1 . Черный профиль соответствует D _Ca = 2 мкм ² s ^-1 . Все кривые соответствуют пику WT SPR. (C) Представление тепловой карты рассчитанных пространственно-временных профилей cGMP во время WT ( слева, ) и GCAP ^{— / —} ( центр ) SPR. Соответствующий профиль Ca ²⁺ ( правый ) показан для WT SPR. Пунктирными линиями обозначено время пиковых амплитуд отклика.

Сводка

Применение биохимических, электрофизиологических и вычислительных подходов к пониманию пространственно-временной динамики передачи сигналов цГМФ в стержнях позвоночных дало очень хорошее общее согласие относительно биохимических скоростей и локальных диффузионных ограничений, лежащих в основе амплитуды, временного хода и воспроизводимости SPR. Унификация нашего понимания различных генетических нарушений у мышей (например, Gross et al., 2012a) и у позвоночных видов (например, Gross et al., 2012a).g., Reingruber et al., 2013) обнадеживает, но предстоит еще много работы. Важно отметить, что режим однофотонного обнаружения стержней составляет только около трех из шести порядков интенсивности, при которых стержни вносят вклад в зрение (например, Naarendorp et al., 2010). С увеличением интенсивности света происходят фундаментальные изменения в биохимических параметрах, буферизации цГМФ и Ca ²⁺ , механизмах обратной связи и динамике цГМФ. Будущая работа будет направлена ​​на развитие нашего понимания пространственно-временной динамики передачи сигналов cGMP в палочках, адаптированных к темноте, путем расширения существующих моделей, чтобы охватить известные и новые механизмы адаптации.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Эймс, Дж. Б., Дижур, А. М., Икура, М., Пальчевски, К., и Страйер, Л. (1999). Трехмерная структура белка-2, активирующего гуанилилциклазу, кальций-чувствительного модулятора фоторецепторных гуанилциклаз. J. Biol.Chem. 274, 19329–19337. DOI: 10.1074 / jbc.274.27.19329

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андреуччи Д., Бисенья П., Карузо Г., Хамм Х. Э. и Дибенедетто Э. (2003). Математическая модель пространственно-временной динамики вторичных посланников в визуальной трансдукции. Biophys. J. 85, 1358–1376. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74570-6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бэйлор, Д. А., Лэмб, Т.Д. и Яу К. В. (1979a). Мембранный ток одностержневых внешних сегментов. J. Physiol. 288, 589–611.

Google Scholar

Бейлор Д. А., Лэмб Т. Д. и Яу К. В. (1979b). Ответы палочек сетчатки на одиночные фотоны. J. Physiol. 288, 613–634.

Google Scholar

Бисенья П., Карузо Г., Андреуччи Д., Шен Л., Гуревич В. В., Хамм Х. Э. и др. (2008). Диффузия вторичных мессенджеров в цитоплазме действует как супрессор вариабельности однофотонного ответа при фототрансдукции позвоночных. Biophys. J. 94, 3363–3383. DOI: 10.1529 / biophysj.107.114058

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бойетт М. Р., Хондзё Х. и Кодама И. (2000). Синоатриальный узел, неоднородная структура водителя ритма. Cardiovasc. Res. 47, 658–687. DOI: 10.1016 / S0008-6363 (00) 00135-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бернс, М. Э., Мендес, А., Чен, Дж., И Бейлор, Д. А. (2002). Динамика циклического синтеза GMP в стержнях сетчатки. Нейрон 36, 81–91. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (02) 00911-X

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бернс, М. Э., и Пью, Э. Н. мл. (2014). «Визуальная трансдукция с помощью фоторецепторов палочки и колбочки», в The New Visual Neurosciences , ред. Дж. С. Вернер и Л. М. Чалупа (Кембридж, Массачусетс: The MIT Press), 7–18.

Google Scholar

Caruso, G., Bisegna, P., Andreucci, D., Lenoci, L., Gurevich, V.V, Hamm, H.E., et al. (2011). Выявление ключевых факторов, снижающих вариабельность однофотонного отклика. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108, 7804–7807. DOI: 10.1073 / pnas.1018960108

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Caruso, G., Bisegna, P., Lenoci, L., Andreucci, D., Gurevich, V.V, Hamm, H.E., et al. (2010). Кинетика дезактивации родопсина и ее роль в регулировании восстановления и воспроизводимости фотоответа палочек. PLoS Comput. Биол. 6: e1001031. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1001031

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коэн, А.И. (1963). Клетки сетчатки позвоночных и их организация. Biol. Ред. 38, 427–459. DOI: 10.1111 / j.1469-185X.1963.tb00789.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дижур, А. М., и Херли, Дж. Б. (1996). Инактивация EF-hands делает GCAP-2 (p24) конститутивным активатором фоторецепторной гуанилилциклазы, предотвращая индуцированный Ca ²⁺ переход «активатор-ингибитор». J. Biol. Chem. 271, 19346–19350. DOI: 10.1074 / jbc.271.32.19346

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дижоор А.М., Ольшевская Е.В., Пещенко И.В. (2010). Mg ²⁺ / Ca ²⁺ катион-связывающий цикл белков, активирующих гуанилилциклазу (GCAP): роль в регуляции фоторецепторной гуанилилциклазы. Mol. Клетка. Биохим. 334, 117–124. DOI: 10.1007 / s11010-009-0328-6

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Филд, Г. Д., и Рике, Ф.(2002). Механизмы регуляции вариабельности однофотонных ответов палочковых фоторецепторов млекопитающих. Нейрон 35, 733–747. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (02) 00822-X

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хамер, Р. Д., Николас, С. К., Транчина, Д., Либман, П. А., и Лэмб, Т. Д. (2003). Множественные стадии фосфорилирования активированного родопсина могут объяснить воспроизводимость однофотонных ответов палочек позвоночных. J. Gen. Physiol. 122, 419–444.DOI: 10.1085 / jgp.200308832

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хек М. и Хофманн К. П. (2001). Максимальная скорость и нуклеотидная зависимость активации трансдуцина, катализируемой родопсином: анализ начальной скорости, основанный на механизме двойного замещения. J. Biol. Chem. 276, 10000–10009. DOI: 10.1074 / jbc.M009475200

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hemilä, S.и Рейтер Т. (1981). Продольное распространение адаптации стержней сетчатки лягушки. J. Physiol. 310, 501–528. DOI: 10.1113 / jphysiol.1981.sp013564

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карпен, Дж. У., Циммерман, А. Л., Страйер, Л., и Бейлор, Д. А. (1988). Кинетика стробирования циклически-GMP-активированного канала палочек сетчатки: импульсный фотолиз и исследования скачков напряжения. Proc. Natl. Акад. Sci. США 85, 1287–1291. DOI: 10.1073 / pnas.85.4.1287

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коренброт, Дж. И., и Миллер, Д. Л. (1989). Концентрация свободного кальция в цитоплазме во внешних сегментах палочек сетчатки, адаптированных к темноте. Vision Res. 29, 939–948. DOI: 10.1016 / 0042-6989 (89)-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коршен, Х. Г., Бейерман, М., Мюллер, Ф., Хек, М., Вантлер, М., Кох, К. В. и др. (1999). Взаимодействие белков, богатых глутаминовой кислотой, с сигнальным путем цГМФ в фоторецепторах палочек. Природа 400, 761–766. DOI: 10,1038 / 23468

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куталос Ю., Браун Р. Л., Карпен Дж. У. и Яу К.-В. (1995a). Коэффициент диффузии циклического аналога GMP 8- (флуоресцеинил) тиогуанозин 3 ‘, 5’ циклический монофосфат в наружном сегменте стержня саламандры. Biophys. J. 69, 2163–2167. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (95) 80090-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куталос, Ю., Накатани К. и Яу К.-В. (1995c). Коэффициент диффузии циклического GMP в наружных сегментах фоторецепторов палочек. Biophys. J. 68, 373–382. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (95) 80198-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Криспел К. М., Чен Д., Меллинг Н., Чен Ю. Дж., Мартемьянов К. А., Куиллинан Н. и др. (2006). Скорость экспрессии RGS ограничивает восстановление фотоответов палочек. Нейрон 51, 409–416. DOI: 10.1016 / j.neuron.2006.07.010

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лесков, И.Б., Кленчин, В. А., Хэнди, Дж. У., Уитлок, Г. Г., Говардовский, В. И., Боундс, М. Д. и др. (2000). Прирост палочковой фототрансдукции: согласование биохимических и электрофизиологических измерений. Нейрон 27, 525–537. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 00063-5

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Макино К. Л., Додд Р. Л., Чен Дж., Бернс М. Э., Рока А., Саймон М. И. и др. (2004). Рековерин регулирует светозависимую активность фосфодиэстеразы в стержнях сетчатки. J. Gen. Physiol. 123, 729–741. DOI: 10.1085 / jgp.200308994

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Макино, К. Л., Пещенко, И. В., Вэнь, X. Х., Ольшевская, Е. В., Баррет, Р., Дижоор, А. М. (2008). Роль GCAP2 в регуляции фотоответа. Активация гуанилилциклазы и палочковая электрофизиология у мышей с нокаутом GUCA1B. J. Biol. Chem. 283, 29135–29143. DOI: 10.1074 / jbc.M804445200

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мендес, А., Бернс, М. Е., Сокал, И., Дижур, А. М., Баер, В., Пальчевски, К. и др. (2001). Роль белков, активирующих гуанилатциклазу (GCAP), в настройке чувствительности к вспышке фоторецепторов палочек. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98, 9948–9953. DOI: 10.1073 / pnas.171308998

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Наарендорп Ф., Эсдайл Т. М., Банден С. М., Эндрюс-Лабенски Дж., Гросс О. П. и Пью Э. Н. мл. (2010). Темный свет, насыщенность стержней, а также абсолютная и возрастающая чувствительность зрения конуса мыши. J. Neurosci. 30, 12495–12507. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2186-10.2010

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Никонов С., Лэмб Т. Д. и Пью Э. Н. мл. (2000). Роль устойчивой активности фосфодиэстеразы в кинетике и чувствительности фотоответа палочки саламандры, адаптированной к свету. J. Gen. Physiol. 116, 795–824. DOI: 10.1085 / jgp.116.6.795

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олсон, А.и Пью, Э. Н. младший (1993). Коэффициент диффузии циклического GMP в наружных сегментах удочки саламандры оценен с помощью двух флуоресцентных зондов. Biophys. J. 65, 1335–1352. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (93) 81177-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пальчевски, К., Поланс, А. С., Бэр, В., и Эймс, Дж. Б. (2000). Са (2 +) — связывающие белки сетчатки: структура, функции и этиология заболеваний зрения у человека. Bioessays 22, 337–350. DOI: 10.1002 / (SICI) 1521-1878 (200004) 22: 4 <337 :: AID-BIES4> 3.0.CO; 2-Z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пальчевски К., Суббарая И., Горчица В. А., Хелекар Б. С., Руис К. К., Огуро Х. и др. (1994). Молекулярное клонирование и характеристика белка, активирующего гуанилилциклазу фоторецептора сетчатки. Нейрон 13, 395–404. DOI: 10.1016 / 0896-6273 (94) -7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пещенко И. В., Дижоор А. М. (2004). Белки, активирующие гуанилилциклазу (GCAP), представляют собой сенсоры Ca ²⁺ / Mg ²⁺ : влияние на регуляцию фоторецепторной гуанилилциклазы (RetGC) в фоторецепторах млекопитающих. J. Biol. Chem. 279, 16903–16906. DOI: 10.1074 / jbc.C400065200

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пещенко И.В., Ольшевская Е.В., Савченко А.Б., Каран С., Пальчевски К., Баер В. и др. (2011). Ферментативные свойства и регуляция нативных изоферментов гуанилилциклазы мембраны сетчатки (RetGC) из фоторецепторов мышей. Биохимия 50, 5590–5600. DOI: 10.1021 / bi200491b

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Поэтч, А., Молдей, Л. Л., и Молдей, Р. С. (2001). ЦГМФ-управляемый канал и связанные с ним белки, богатые глутаминовой кислотой, взаимодействуют с периферином-2 в краевой области мембран диска палочек фоторецепторов. J. Biol. Chem. 276, 48009–48016.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Пью, Э. Н. мл., И Лэмб, Т. Д. (1993). Усиление и кинетика стадий активации фототрансдукции. Biochim. Биофиз. Acta 1141, 111–149. DOI: 10.1016 / 0005-2728 (93)-H

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейнгрубер, Дж.Р., Палберг, Дж., Вудрафф, М. Л., Сампат, А. П., Файн, Г. Л., и Холкман, Д. (2013). Обнаружение одиночных фотонов стержнями жабы и мыши. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 19378–19383. DOI: 10.1073 / pnas.1314030110

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Риттер, Л. М., Хаттри, Н., Там, Б., Мориц, О. Л., Шмитц, Ф., и Голдберг, А. Ф. (2011). Визуализация in situ белковых взаимодействий в сенсорных нейронах: белки, богатые глутаминовой кислотой (GARP), играют разные роли в каркасе внешнего сегмента фоторецепторов. J. Neurosci. 31, 11231–11243. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2875-11.2011

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руис М., Браун Р. Л., Хе Ю., Хейли Т. Л. и Карпен Дж. У. (1999). Взаимосвязь одноканальной доза-реакция постоянно крутая для стержневых циклических нуклеотид-управляемых каналов: последствия для интерпретации макроскопических зависимостей доза-реакция. Биохимия 38, 10642–10648. DOI: 10.1021 / bi9

w

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сампат, А.П., Мэтьюз, Х. Р., Корнуолл, М. К., и Фейн, Г. Л. (1998). Обесцвеченный пигмент вызывает устойчивое снижение внешнего сегмента Ca ²⁺ в палочках саламандры. J. Gen. Physiol. 111, 53–64. DOI: 10.1085 / jgp.111.1.53

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шварцер А., Шауф Х. и Бауэр П. Дж. (2000). Связывание cGMP-закрытого канала с обменником Na / Ca-K в палочковидных фоторецепторах. J. Biol. Chem. 275, 13448–13454. DOI: 10.1074 / jbc.275.18.13448

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шуарт, Н. Г., Хайтин, Ю., Кэмп, С. С., Блэк, К. Д., и Заготта, В. Н. (2011). Молекулярный механизм стехиометрии субъединиц 3: 1 стержневых циклических нуклеотидно-управляемых ионных каналов. Nat. Commun. 2, 457–457. DOI: 10.1038 / ncomms1466

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тао, Т., Патерсон, Д. Дж., И Смит, Н. П. (2011). Модель клеточного сердечно-нервного взаимодействия, которая отражает симпатический контроль возбудимости синоатриального узла у нормотензивных и гипертензивных крыс. Biophys. J. 101, 594–602. DOI: 10.1016 / j.bpj.2011.05.069

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вудрафф, М. Л., Сампат, А. П., Мэтьюз, Х. Р., Красноперова, Н. В., Лем, Дж., И Файн, Г. Л. (2002). Измерение концентрации цитоплазматического кальция в палочках мышей дикого типа и мышей с нокаутом трансдуцина.