Комплексные сеты: Суперсет, комплексный сет, джамп-сет — используем в тренировках

В нотации с построением множеств мы можем обозначить множество комплексных чисел как:

\ begin {align} \ quad \ mathbb {C} = \ {a + bi: a, b \ in \ mathbb {R} \: \ mathrm {and} \: i = \ sqrt {-i} \} \ конец

Кроме того, мы можем выразить любое комплексное число $ z = a + bi $ через его действительную и мнимую части как:

\ begin {align} \ quad z = \ mathrm {Re} (z) + \ mathrm {Im} (z) i \ end {align}

Другое обозначение действительной части комплексного числа $ z $ — $ \ Re (z) $, а другое обозначение мнимой части комплексного числа $ z $ — $ \ Im (z) $.2 $.

Например, рассмотрим комплексное число $ z = 2 + 3i $. Мы можем думать об этом числе как о точке $ (2, 3) $ на комплексной плоскости и представлять ее как таковую или даже как вектор, начальная точка которого является началом координат, а конечная точка — $ (2, 3) $, как показано на рисунке. ниже:

Обратите внимание, что множество точек $ z \ in \ mathbb {C} $, для которых $ \ mathrm {Im} (z) = 0 $, является просто действительной прямой, а множество точек, для которых $ \ mathrm {Re} (z) = 0 $ — это просто воображаемая линия. Таким образом, реальная и мнимая линии вложены в комплексную плоскость.

Как использовать сложные программы для наращивания мышц

Около 20 лет назад тренеры по силовой и кондиционной подготовке начали искать лучшие способы разогреть своих спортсменов, минимизируя время, чтобы поддерживать эффективный темп тренировки. Они придумали сложную программу, в которой одна штанга или набор гантелей использовались для выполнения нескольких различных упражнений, связанных вместе, чтобы сформировать программу.

Слово «комплекс» имеет прямое словарное значение «взаимосвязанное целое, состоящее из многих частей» и / или «сложно выполнить, проанализировать или решить.В переводе с языка тренажерного зала это означает «Приготовься к одной интенсивной тренировке».

В любом случае, если вы увеличите вес, вы сможете перейти на совершенно новый уровень сжигания и нарастить много мышц в процессе.

Получение комплекса

Сложная программа состоит из нескольких упражнений, соединенных вместе, которые образуют либо сегменты большого подъемника, либо полностью автономные упражнения, позволяющие проработать все тело за один период. В любом случае вы устанавливаете один вес — либо на штангу, либо с гантелями — а затем устанавливаете схему повторений.

Пример первого сложного сценария включает движение в сторону толчка. Начиная со становой тяги, вы затем переходите к тягам стоя, жимам или толчкам и, наконец, к полным повторениям толчка и толчка. Другими словами, подъем толчком и толчком прерывается, и каждый сегмент подъема тренируется перед выполнением всего подъема целиком.

Во втором сценарии вы можете использовать более изолированный подход, такой как становая тяга, приседания, тяги на бенте, жимы плечами, разгибания на трицепс, сгибания рук на бицепс, а затем закончить отжиманиями, чтобы завершить комплекс.

Так что же делает это таким трудным? Упражнения выполняются по схеме без отдыха. Это означает, что когда вы заканчиваете последнее повторение упражнения, вы уже начинаете следующее упражнение из вашего списка. Как правило, в комплекс входит 4-6 упражнений (но вы можете использовать и больше) по 8-20 повторений каждое. В комплексе нет отдыха между переходами, поэтому средний комплексный подход длится две мучительные минуты. Затем каждое сложное упражнение выполняется еще 2-4 раза.

Ключи — поддерживать форму и технику и, конечно же, выполнять рутину.Этот тип тренировок требует серьезной дисциплины, и, хотя вы увидите некоторые преимущества для вашей общей мышечной массы, именно ваша выносливость, атлетизм и общая сила доведены до предела с этим типом тренировок.

Попробуйте сегодня любую из следующих сложных программ для своей тренировки, выполняя выбранный комплекс 4-6 раз, выполняя 8-20 повторений каждого упражнения. Если ваша главная цель — сила, стремитесь к большему весу / меньшему количеству повторений. Если вашей целью является выносливость и расход калорий во время тренировки, тренируйтесь с меньшим весом и большим количеством повторений.

Примечание к тренировке: Помните, что вы будете выбирать один вес для использования всего комплекса, поэтому выберите такой вес, который позволит вам выполнить как минимум желаемое минимальное количество повторений для каждого движения.

Комплекс из 5 упражнений

Подходы: 3-5
Повторения: 8-20
Вес: Выберите вес, с которым вы можете справиться в выбранном диапазоне повторений для каждого упражнения в комплексе.
Отдых: Между упражнениями: нет; Между комплексами: 2-3 минуты

Комплекс 1

• Становая тяга румынская
• Вертикальный ряд
• Повесить
• Подруливающее устройство
• Рывок в шпагат

Комплекс 2

• Приседания
• Плиометрические приседания
• Прыжок с выпадом в шпагате
• Рывок в шпагат
• Очистить до пресса

Комплекс 3

• Вертикальный ряд
• Рывок висячий
• Жим от плеч
• Приседания со штангой
• Рывок висячий

Комплекс 4

• Висячий крюк
• Вертикальный ряд
• Тяга в наклоне
• Подруливающее устройство
• Рывок висячий

Комплекс 5

• Становая тяга румынская
• Вертикальный ряд
• Повесить
• Подруливающее устройство
• Рывок в шпагат

Комплекс из 6 упражнений

Подходы: 3-5
Повторения: 8-20
Вес: Выберите вес, с которым вы можете справиться в выбранном диапазоне повторений для каждого упражнения в комплексе.
Отдых: Между упражнениями: нет; Между комплексами: 2-3 минуты

• Пресс Арнольд
• Становая тяга с прямыми ногами
• Тяга в наклоне
• Подруливающее устройство
• Приседания
• Становая тяга с прямыми ногами

Комплекс из 8 упражнений

Подходы: 3-5
Повторения: 8-20
Вес: Выберите вес, с которым вы можете справиться в выбранном диапазоне повторений для каждого упражнения в комплексе.
Отдых: Между упражнениями: нет; Между комплексами: 2-3 минуты

• Завиток
• Вертикальный ряд
• Тяга в наклоне
• Рывок висячий
• Жим от плеч
• Подруливающее устройство
• Вертикальный ряд
• Завиток

Комплекс из 9 упражнений

Подходы: 3-5
Повторения: 8-20
Вес: Выберите вес, с которым вы можете справиться в выбранном диапазоне повторений для каждого упражнения в комплексе.
Отдых: Между упражнениями: нет; Между комплексами: 2-3 минуты

• Пресс Арнольд
• Становая тяга с прямыми ногами
• Тяга в наклоне
• Приседания
• Вертикальный ряд
• Рывок висячий
• Подруливающее устройство
• Тяга в наклоне
• Рывок висячий

комплексных чисел

Примечания, Урок 3.2
Комплекс Номера

Теперь нам нужно работать над сложением, вычитанием и умножение комплексные числа.Хотя i не является переменной (Это конкретно квадратный корень из -1), в алгебраических операциях он «действует» таким образом.

Пример добавления:

Пример вычитания:

Комплексные числа | Блестящая вики по математике и науке

Сложение комплексных чисел следует алгебраическому принципу объединения одинаковых членов. Действительные части комплексных чисел считаются одинаковыми, и, аналогично, сложные части считаются одинаковыми.

Сложение комплексных чисел:

Для комплексных чисел a + bi a + bi a + bi и c + di c + di c + di их сумма равна

.

(а + в) + (б + г) и. (а + в) + (б + г) я. (а + в) + (б + г) я.

Что такое (4 + 3i) + (2 + 2i)? (4 + 3i) + (2 + 2i)? (4 + 3i) + (2 + 2i)?

---

Складывая отдельно действительную и мнимую части, получаем

4 + 3i + 2 + 2i = (4 + 2) + (3 + 2) i = 6 + 5i. □ 4 + 3i + 2 + 2i = (4 + 2) + (3 + 2) i = 6 + 5i. \ _ \ Square4 + 3i + 2 + 2i = (4 + 2) + (3 + 2) i = 6 + 5i. □

Обратите внимание, что действительные числа добавлялись только к другим действительным числам, а мнимые числа добавлялись только к другим мнимым числам.

Несколько дополнительных примеров:

• (3−4i) + (3 + 2i) = 6−2i (3-4i) + (3 + 2i) = 6-2i (3−4i) + (3 + 2i) = 6−2i
• (4−2i) — (- 2−5i) = 6 + 3i (4-2i) — (- 2-5i) = 6 + 3i (4−2i) — (- 2−5i) = 6 + 3i
• (3i) + (3 + 5i) = 3 + 8i (3i) + (3 + 5i) = 3 + 8i (3i) + (3 + 5i) = 3 + 8i

Умножение комплексных чисел соответствует принципу умножения биномов. Одно заметное отличие состоит в том, что при умножении мнимых членов получается действительное число.

Умножение комплексных чисел:

Для двух комплексных чисел a + bi a + bi a + bi и c + di c + di c + di их произведение равно

.

(a + bi) × (c + di) = a (c + di) + bi (c + di) = (ac) + (ad) i + (bc) i + (bd) i2 = (ac) + (ad + bc) я + (bd) (- 1) = (ac − bd) + (ad + bc) i.2 \\ & = (ac) + (ad + bc) i + (bd) (- 1) \\ & = (ac — bd) + (ad + bc) i. \ end {align} (a + bi) × (c + di) = a (c + di) + bi (c + di) = (ac) + (ad) i + (bc) i + (bd) i2 = ( ac) + (ad + bc) i + (bd) (- 1) = (ac − bd) + (ad + bc) i.

Примечание: Лучше не запоминать приведенную выше формулу, так как умножение двух комплексных чисел может выполняться так же, как обычное умножение двух вещественных выражений.

Что такое (3 + 2i) (4−2i)? (3 + 2i) (4-2i)? (3 + 2i) (4−2i)?

---

Решение 1:
По определению выше, a = 3, b = 2, c = 4, d = −2 a = 3, b = 2, c = 4, d = -2a = 3, b = 2, c = 4, d = −2, поэтому произведение равно

(12 — (- 4)) + (- 6 + 8) i = 16 + 2i.2 \\ & = 16 + 2i. \ _ \ Квадрат \ end {align} (3 + 2i) (4−2i) = 3 (4−2i) + 2i (4−2i) = 12−6i + 8i − 4i2 = 16 + 2i. □

Решите следующее выражение:

−3 × −2. 4? I2 + i6 + i4?

Примечание: iii — мнимое число −1 \ sqrt {-1} −1.2-2x + 5 \ большой) \ влево (x + 4 \ вправо) + 7x + 5 \\ & = 0 \ cdot (x + 4) + 7x +5 \ qquad \ qquad \ qquad \ big (\ text {by} (1) \ big) \\ & = 7 (1 + 2i) + 5 \\ & = 12 + 14i. \ _\квадратный \ end {align} x3 + 2×2 + 4x + 25 = (x2−2x + 5) (x + 4) + 7x + 5 = 0⋅ (x + 4) + 7x + 5 (по (1)) = 7 (1 + 2i) + 5 = 12 + 14i. □

Отдел комплексных чисел:

Если Z1 = a + ibZ_1 = a + ibZ1 = a + ib и Z2 = c + idZ_2 = c + idZ2 = c + id — любые два комплексных числа, то деление двух комплексных чисел выполняется с помощью всего рационализаторов. комплексное число или , умноженное и разделенное на сопряжение знаменателя .

Это обсуждается в следующем разделе.

Исходное состояние комплекса ДНК-краситель создает основу для индуцированной белком модуляции флуоресценции

ДНК-опосредованная двунаправленная модуляция флуоресценции

Мы недавно использовали smFRET, чтобы охарактеризовать механизм распознавания субстрата двойного лоскута (DF) посредством репликации и репарации ДНК Эндонуклеаза лоскута 1 (FEN1) ²⁵ . Вкратце, FEN1 отщепляет лишние 5′-створки от ДНК, проникая 5′-створки в закрытый спиральный шлюз ^25,26 .In-vitro DF получают путем отжига трех различных олигонуклеотидов для создания зазубрины, несущей 5′-лоскут одноцепочечной ДНК (оцДНК) переменной длины и 3′-лоскут из 1 нуклеотида (nt); эти субстраты называются DF- (длина 5′-створки), (длина 3′-створки). Ранее мы использовали схему мечения, которая использует Cy3, присоединенный через фосфорамидитную связь (далее здесь и далее, как pCy3), на кончике 5′-лоскута (Fig. 2a) ^25,27,28 . Мы были озадачены фотофизическим белком тушения pCy3 ²⁵ .Спектры стационарной флуоресценции pCy3 в DF-6,1 демонстрируют основное гашение флуоресценции, индуцированное FEN1, без какого-либо спектрального сдвига (дополнительный рис. 2а). Это гашение показало зависимость от длины створки (дополнительный рис. 2b), аналогичную зависимости от расстояния PIFE ² . Известные механизмы гашения не могут объяснить этот наблюдаемый эффект, поскольку FEN1 не содержит кластеров железа и серы, а карбоцианиновые красители не могут быть погашены с помощью ПЭТ остатками триптофана или азотистыми основаниями гуанозина ^29,30 .Таким образом, мы заключаем, что это тушение pCy3 является отдельным наблюдением, и называем его тушением флуоресценции, индуцированным белком (PIFQ), аналогично PIFE.

ДНК-опосредованная двунаправленная модуляция флуоресценции в системе FEN1 / DF. a Схема, показывающая олигонуклеотид, несущий pCy3 на своем 5′-кончике, отожженный с двумя другими олигонуклеотидами с образованием двойной лоскутной структуры (DF), которая служит субстратом для FEN1. Часть лоскута оцДНК в DF проходит через узкий путь в FEN1, чтобы произошло расщепление. b Время жизни флуоресценции с временным разрешением затухает для Cy3 только в олиго (серый) при создании субстрата DF (синий) и при добавлении FEN1 к субстрату DF (голубой) с 5′-створкой длиной 6 нт. c Столбчатая диаграмма, показывающая время жизни флуоресценции с временным разрешением Cy3 в одном олиго, после изготовления субстрата DF и после добавления FEN1 к субстрату DF для створок длиной 2–18 (цветовая схема такая же, как у b ). Время жизни флуоресценции свободного красителя Cy3 указано (фиолетовым цветом) для сравнения. d График, показывающий процент изменения времени жизни флуоресценции после отжига DF-подложки и связывания FEN1 с отожженной подложкой в ​​зависимости от длины лоскута. e Гистограмма, показывающая время жизни флуоресценции с временным разрешением только для Cy3B-меченых олигонуклеотидов при изготовлении субстрата DF и после добавления FEN1 к субстрату DF для лоскутов длиной 2, 4 и 6. Cy3B связан с ДНК через 13-углеродный линкер. f Столбчатая диаграмма, показывающая время жизни флуоресценции с временным разрешением Cy3 в одном олиго после получения субстрата DF и после добавления FEN1 к субстрату DF для 5′-лоскута длиной 6 нт с различными последовательностями лоскута. г График, показывающий процент изменения флуоресценции, основанный на измерениях времени жизни в субстратах DF для разных флуорофоров и разных линкеров, с FEN1 и без него. pCy3 связан с ДНК через 3-углеродный линкер. Другие используемые флуорофоры: Cy3B, nCy3, pCy5, Alexa Fluor 555 и Alexa Fluor 647. h График, показывающий процентное изменение флуоресценции Cy3 при отжиге субстрата и добавлении FEN1, когда pCy3 включен внутри лоскута оцДНК. В таблице-вставке указаны длина створки, последовательность и время жизни флуоресценции.Планки погрешностей и ± представляют стандартное отклонение (SD) для трех повторов. Последовательности олигонуклеотидов перечислены в дополнительной таблице 1

Затем мы использовали систему FEN1 / DF, чтобы охарактеризовать природу PIFQ и факторы, которые на нее влияют. Мы исследовали, опосредован ли наблюдаемый PIFQ самой ДНК или FEN1, непосредственно влияющим на фотофизику pCy3. Мы измерили время жизни флуоресценции pCy3 с временным разрешением для каждой длины лоскута в трех контекстах: (1) меченный 5′-pCy3 олиго, субстрат DF, меченный pCy3, без (2) и с FEN1 (3) (рис.2а). Это подтвердило поведение тушения, вызванное FEN1 (например, случай DF-6,1; рис. 2b). Удивительно, но время жизни pCy3 в одном олиго было значительно ниже, чем у DF. Следовательно, после отжига олигонуклеотидов с образованием DF флуоресценция pCy3 резко усиливалась, и связывание FEN1 уменьшало это усиление обратно до такого же уровня, как и в случае одного олиго. Это усиление флуоресценции в контексте взаимодействий нуклеиновая кислота-нуклеиновая кислота, например, при образовании DF, называется усилением флуоресценции, индуцированным нуклеиновой кислотой (NAIFE) ¹² .Такая же тенденция наблюдалась при разной длине лоскута (рис. 2c). Интересно, что хотя разные олигонуклеотиды имели сходное начальное время жизни флуоресценции, их уровни NAIFE снижались по мере увеличения длины лоскута. Это предполагает, что наблюдаемый NAIFE в первую очередь вызван взаимодействием Cy3 с гибридной ДНК. Процент изменения продолжительности жизни в зависимости от длины створки показывает антикоррелированное поведение, характеризующееся увеличением флуоресценции при образовании субстрата, которому противодействует связывание FEN1 с субстратами DF (рис.2г). Следовательно, этот NAIFE вызывает последующий эффект гашения. Таким образом, наблюдение может быть лучше понято с точки зрения ДНК как посредника изменения флуоресценции, а не с точки зрения белка, являющегося активным реконфигуратором флуоресценции.

Чтобы учесть NAIFE при формировании субстрата DF и последующего PIFQ, мы рассмотрели различные возможности. Сначала мы исключили любое статическое тушение, вызванное основным состоянием, показав, что связывание FEN1 не вызывает каких-либо значительных изменений в оптической плотности субстратов DF (дополнительный рис.2c), время жизни флуоресценции и квантовый выход (рис. 2c, d и дополнительный рис. 2e, f) следуют аналогичной тенденции. Чтобы проверить, аналогичны ли модуляции флуоресценции в системе FEN1 / DF таковым в PIFE, особенно в отношении модуляции фотоизомеризации, мы заменили pCy3 на Cy3B в нашей трехконтекстной системе на три длины лоскута. Cy3B является аналогом красителя Cy3, но с жесткой межгетероциклической структурой, которая делает его неспособным к фотоизомеризации ^2,3 (дополнительный рис.1). Время жизни флуоресценции Cy3B-ДНК в трехконтекстной системе при разной длине лоскута не различается (рис. 2e). Более того, теоретическая полная безызлучательная потеря времени жизни возбужденного состояния антикоррелировала со временем жизни флуоресценции pCy3 в трехконтекстной системе (дополнительный рис. 2d) и была значительно выше, чем у Cy3B, с учетом потери фотоизомеризации. Потери фотоизомеризации были подтверждены путем непосредственной оценки скорости фотоизомеризации, как описано в разделе Методы SI (дополнительный рис.2-я вставка). В заключение, эксперименты Cy3B, наряду с теоретической полной безызлучательной потерей времени жизни и скоростями фотоизомеризации, показывают, что для системы, меченной pCy3, и NAIFE, и PIFQ являются результатом цис-транс-фотоизомеризации в возбужденном состоянии.

Чтобы исследовать образование взаимодействий ДНК-краситель ^8,31,32,33 , мы выполнили стационарные измерения анизотропии с временным разрешением с меченным pCy3 DF в трехконтекстной системе; В качестве контроля мы выполнили эти измерения с Cy3B-меченным DF (дополнительный рис.2г, з). Результаты показали, что существуют взаимодействия, ограничивающие свободу вращения красителя, и эти взаимодействия усиливаются при отжиге субстрата и уменьшаются при связывании FEN1. Более того, существует сильная корреляция между этими взаимодействиями, что отражено в локальной вращательной диффузии красителя и скоростью фотоизомеризации из возбужденного транс-состояния (дополнительный рис. 2h-вставка), что позволяет предположить, что свобода красителя и его доступность для фотоизомеризации сильно связаны.

Чтобы исследовать влияние непосредственных азотистых оснований на NAIFE и PIFQ, мы зафиксировали длину 5′-лоскута, но изменили его последовательность, и показали, что, хотя время жизни pCy3-DF зависело от последовательности, FEN1 подавлял флуоресценцию pCy3 во всех случаях. конструкции (рис. 2е). Это подтверждает наши выводы о том, что PIFQ, как это определено с точки зрения связывания с белками, по существу опосредуется ДНК и что FEN1 просто меняет NAIFE.

После этого мы охарактеризовали влияние типов флуорофоров и химии их присоединения на PIFQ.Используя субстраты DF с переменной длиной 5′-створок, мы исследовали модуляцию флуоресценции, индуцированную FEN1, в случае Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 647 и Cy3 (nCy3), связанных через NHS, а также Cy5, связанного через фосфорамидит (pCy5) в кончик 5′-лоскута. Мы показали, что pCy3, nCy3 и pCy5 показали значительный PIFQ, в то время как Alexa Fluor 555 и Alexa Fluor 647 показали только средний или низкий PIFE, соответственно (рис. 2g). Этот результат подчеркивает тот факт, что наблюдаемый эффект гашения не является специфическим для pCy3 явлением.Различия в модуляции флуоресценции этих флуорофоров можно объяснить различиями в длине их полиметиновых связей, их общем заряде и наличии / отсутствии сульфонатных групп (дополнительный рисунок 1).

Затем мы исследовали возможные последствия изменения положения флуорофора в 5′-лоскуте. Присоединение pCy3 к кончику 5′-лоскута ограничивало его вращательную свободу, о чем свидетельствует его более длительный срок службы по сравнению со свободным красителем Cy3 (рис. 2c). Затем мы ограничили pCy3 дальше с обеих сторон, поместив его внутри в позицию 4 на 5′-створке, постепенно добавляя 1 нт к его 5′-стороне.Мы наблюдали, что как NAIFE, так и PIFQ постепенно снижались при добавлении одного или двух dT и выходили на более низкий уровень при дополнительных добавках (рис. 2h). Поэтому мы постулируем, что pCy3 при ограничении только с одной стороны или немного с другой стороны (1 dT) может быть способен формировать взаимодействия с соседними нуклеотидами, которые будут потеряны с дальнейшими ограничениями, что приведет к общему снижению модуляции флуоресценции. Эти взаимодействия, если они присутствуют, снизят скорость фотоизомеризации из возбужденного транс-конформера.

В совокупности эти эксперименты предполагают, что взаимодействия pCy3 с соседней ДНК являются основной причиной NAIFE при отжиге субстрата, а связывание FEN1 нарушает эти взаимодействия, приводя к наблюдаемому PIFQ. Более того, они предполагают, что на фотофизические свойства Cy3 в конкретном субстрате влияет общая структура ДНК-краситель и взаимодействия внутри него.

Начальное время жизни Cy3-ДНК закладывает основу для PIFE или PIFQ

Чтобы изучить универсальность PIFQ и его адаптивность к другим системам, мы исследовали взаимодействие оцДНК-связывающего белка человека RPA с оцДНК ^34,35 (рис. .3а). Эта система устраняет особенности DF NAIFE и предлагает общую систему связывания ДНК с белками. Мы разработали библиотеку олигонуклеотидов, меченных pCy3, с различными последовательностями, положениями флуорофора и типами флуорофора (дополнительная таблица 1).

Начальное время жизни Cy3-DNA создает основу для PIFE или PIFQ. a Схема, описывающая эффект связывания RPA с pCy3-меченным олиго с разными последовательностями и разными положениями флуорофора, что приводит либо к тушению, либо к усилению флуоресценции. b Время жизни флуоресценции библиотеки 16 3′-pCy3-меченых олиго с различными последовательностями, с RPA (синий) или без (серый). Пунктирная линия показывает среднее время жизни флуоресценции в присутствии RPA. Коэффициент Пирсона корреляции между начальным временем жизни флуоресценции (в отсутствие RPA) и изменением флуоресценции (%) сообщается со стандартной ошибкой. c Показана библиотека из 22 меченных 5′-pCy3 олигонуклеотидов с их временами жизни флуоресценции в отсутствие (серый) и присутствие (зеленый) RPA (как описано в b ).Зеленая вертикальная пунктирная линия ограничивает олигонуклеотиды, которые демонстрируют общий эффект PIFE при добавлении RPA, тогда как красная вертикальная пунктирная линия ограничивает те, которые демонстрируют общий эффект гашения. d Гистограмма, показывающая время жизни флуоресценции библиотеки, состоящей из 15 олигонуклеотидов, меченных внутренне pCy3, в отсутствие (серый) и в присутствии RPA (фиолетовый). Горизонтальная пунктирная линия, коэффициент Пирсона, зеленые и красные вертикальные пунктирные линии соответствуют описанию в c . e Представление эффекта типа и положения флуорофора (шесть различных положений, где O-278 имеет 5′-метку, O-279–> O-282 внутреннюю метку и O-283 3′-метку).Изменения флуоресценции (%) после добавления RPA показаны для шести олигонуклеотидов с разными типами флуорофоров и химическим составом связей (pCy3 в голубом, nCy3 в зеленом, Cy3B в черном, Alexa Fluor 555 в пурпурном, Alexa Fluor 647 в синий, pCy5 красным и DyLigth633 оранжевым). Горизонтальная пунктирная линия представляет собой нулевую линию. Изменение времени жизни флуоресценции (%) при добавлении gp2.5 (зеленый), RPA (серый) или SSB (красный) к олигонуклеотидам из библиотеки, меченной 3′-pCy3 ( f ), библиотеки, меченной 5′-pCy3 ( g ) и внутреннюю библиотеку, меченную pCy3 ( h ).Приводятся средние конечные сроки жизни после добавления белка. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех повторов и ± стандартную ошибку среднего (SEM). Последовательности олигонуклеотидов перечислены в дополнительной таблице 1

Наша библиотека включает 16 3′-pCy3-меченных олигонуклеотидов с различными последовательностями и начальным временем жизни флуоресценции в диапазоне от 0,5 до 1,5 нс (рис. 3b). После связывания RPA все олигонуклеотиды в разной степени проявляли PIFE. Однако их окончательное время жизни флуоресценции в присутствии RPA, по-видимому, в среднем составляет около 1.66 нс, независимо от их начального срока службы. В общем, степень PIFE, по-видимому, зависела от начальной продолжительности флуоресценции самого олиго.

На 5′-стороне начальное время жизни флуоресценции 21 pCy3-меченого олиго колебалось от 0,7 до 2,2 нс (рис. 3c). Эта библиотека демонстрирует гибкую модуляцию флуоресценции, индуцированную RPA, включая усиление флуоресценции, гашение или незначительный эффект. В целом, мы наблюдали, что начальное время жизни флуоресценции олигонуклеотидов, по-видимому, диктовало индуцированную RPA модуляцию флуоресценции со значительной антикорреляцией между начальным временем жизни и изменением флуоресценции.В большинстве случаев олиго со временем жизни 1 нс или ниже показали PIFE, тогда как олиго со временем жизни 1,3 нс или выше показали PIFQ; олиго со средней продолжительностью жизни не показали каких-либо значительных изменений. Тем не менее, независимо от типа эффекта, RPA, по-видимому, доводил время жизни флуоресценции олигонуклеотидов до определенного порога 1,27 нс.

Библиотека из 15 олигонуклеотидов, меченных внутренне pCy3, показывала различные начальные времена жизни, которые варьировались от 0,9 до 2,6 нс (рис. 3d). Удивительно, но O-328 с начальным сроком службы 2.6 нс (рис. 3d), показывает еще большее время жизни флуоресценции, чем у Cy3B (2,4 нс; рис. 2e). Эта библиотека показала универсальные модуляции флуоресценции, хотя и с большинством PIFE. Подобно 3′- и 5′-библиотекам, модуляция флуоресценции, индуцированная RPA, по-видимому, доводила время жизни флуоресценции олигонуклеотидов до более высокого определенного порога (1,78 нс). Кроме того, измерения стационарной флуоресценции подтвердили, что RPA-индуцированная модуляция флуоресценции олигонуклеотидов в трех библиотеках (дополнительный рис.3в).

Затем мы добавили еще одно измерение к разнообразию нашей библиотеки, варьируя типы и положения флуорофоров. Мы протестировали семь разных флуорофоров, каждый из которых был размещен в шести разных положениях. За исключением Cy3B, все флуорофоры содержали полиметиновую связь, способную подвергаться цис-транс-фотоизомеризации (дополнительный рис. 1). Стоит отметить, что последовательность этих олигонуклеотидов в принципе сохраняется; однако изменение положения флуорофора влечет за собой изменение локальной последовательности, воспринимаемой флуорофором.RPA индуцировал PIFE в большинстве флуорофоров в разных положениях, за исключением Cy3B и 5′-конца pCy5. Этот PIFE был значительным для pCy3, nCy3 и Alexa Fluor 647 (20–80%), но значительно повышен для Alexa Fluor 555 (80–160%) (рис. 3e). Доминирующий результат PIFE может быть результатом дизайна эксперимента, в котором использовалась только одна конкретная последовательность, вероятно, с низким начальным временем жизни флуоресценции.

Установив, что начальное время жизни флуоресценции комплекса ДНК-краситель закладывает основу для модуляции флуоресценции, индуцированной RPA, мы попытались выяснить, индуцируют ли другие оцДНК-связывающие белки аналогичные модуляции флуоресценции pCy3 (рис.3f – h). Мы измерили изменения флуоресценции при связывании E. coli SSB или T7 gp2.5 с каждым из олигонуклеотидов в трех библиотеках и сравнили их с таковыми для RPA. Эти измерения подтвердили, что средняя конечная продолжительность жизни после связывания с белком была специфичной для белка. Тем не менее, общая тенденция, согласно которой тип модуляции флуоресценции определяется разницей между исходным состоянием вариабельной ДНК-красителя и специфичным для белка конечным состоянием, применима. Однако разница в средних конечных сроках жизни между разными белками повлияла на амплитуду изменения, а в некоторых случаях даже на направление изменения; Эти результаты могут быть дополнительно визуализированы с помощью диаграмм (дополнительный рис.3а).

Наконец, аналогично случаю системы FEN1 / DF, мы выполнили измерения анизотропии флуоресценции с временным разрешением на подмножестве концевых меченых олигонуклеотидов. Результаты указывают на сильную корреляцию между локальной вращательной свободой красителя и скоростью его фотоизомеризации в исходном состоянии (дополнительный рис. 3b).

Структурные свойства комплексов ДНК-краситель

Этот набор экспериментов разработан для дальнейшего исследования начального состояния флуоресценции библиотеки олигонуклеотидов путем изучения роли различных внешних модуляторов на общую структуру ДНК-краситель и свободу вращения. при отсутствии белка.Предполагая, что PIFE является эффектом, аналогичным присутствию вискогена, мы исследовали влияние изменения концентрации глицерина на время жизни флуоресценции для нескольких конструкций ДНК (рис. 4a). Хотя большинство этих конструкций, за исключением Cy3B, реагировали на увеличение концентрации глицерина увеличением их срока службы, они демонстрировали широкий диапазон начальных времен жизни (время жизни при 0% глицерина) и различную реакцию на увеличение вязкости. Однако конечное время жизни (время жизни при 100% глицерине) для всех конструкций, по-видимому, приближалось к аналогичному значению, поскольку фотоизомеризация полностью подавлялась бы при высокой концентрации вискогена.

Анализ структурных свойств комплексов ДНК-краситель. a Влияние вязкости на флуоресценцию; гистограммы представляют время жизни флуоресценции различных флуорофоров (свободных или комплексов ДНК-краситель) при возрастающих концентрациях глицерина (0–100%) с шагом 10%. b Зависимость времени жизни флуоресценции без глицерина от вязкости. График показывает линейную зависимость с наклоном 0,44 ± 0,02 нс сП и точкой пересечения по оси Y, равной 0.13 ± 0,04 нс. Горизонтальные полосы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего. Качество линейной посадки, значение R ² , составляет 0,989. c Время жизни флуоресценции 11 внутренней библиотеки pCy3-меченых олиго с различными последовательностями (серый цвет) и их соответствующей дцДНК (красный цвет). Горизонтальная пунктирная линия показывает среднее время жизни флуоресценции дцДНК в этой библиотеке. Зеленая вертикальная пунктирная линия ограничивает олиго, которые демонстрируют общий эффект NAIFE после отжига их комплементарной цепи, тогда как красная вертикальная пунктирная линия ограничивает олигонуклеотидов, демонстрирующих общий эффект NAIFQ.Коэффициент Пирсона корреляции между начальным временем жизни флуоресценции (оцДНК) и изменением флуоресценции (%) при отжиге комплементарного олиго представлен с соответствующей стандартной ошибкой. d Пейзаж времени жизни флуоресценции Cy3, объединяющий все времена жизни Cy3, измеренные в этом исследовании ( N = 398). Горизонтальная пунктирная линия представляет собой медианное значение ландшафта. e Гистограмма, показывающая время жизни флуоресценции O-328 и его производных в формах оцДНК (серый) и дцДНК (черный), измеренное в буфере RPA. f Гистограмма, показывающая время жизни флуоресценции O-328 в форме оцДНК в различных отдельных компонентах буфера RPA. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение от трех повторов и ± стандартное стандартное отклонение. Последовательности олигонуклеотидов перечислены в дополнительной таблице 1

Для более количественного подхода динамическая вязкость ^36,37 , пересчитанная из процентного содержания глицерина (диапазон 0–60%; дополнительный рисунок 4a), была нанесена на график в зависимости от времени жизни флуоресценции различные конструкции ДНК (дополнительный рис.4б). Полученные кривые были аппроксимированы гиперболой типа Михаэлиса-Ментен, где K _1/2 представляет динамическую вязкость, при которой достигается половина максимального времени жизни флуоресценции. Как правило, конструкции с более широким динамическим диапазоном сроков службы приводили к более высоким значениям K _1/2 , в результате значительной разницы между их начальным сроком службы и максимальным сроком службы (дополнительный рисунок 4b). Когда начальные времена жизни построены против значений, обратных значению K _1/2 , наблюдается поразительная линейная зависимость (рис.4б). Эта линейная зависимость четко выделяет три класса связывания красителей, то есть свободный краситель или ДНК-связанный с одной или двух сторон. Начальный срок службы определяется скоростью, которая может быть далее разделена на две составляющие: скорости, зависящие от фотоизомеризации и не зависящие от фотоизомеризации (см. Методы SI). Независимая от фотоизомеризации скорость показала ~ 1,3-кратную разницу между свободным Cy3 и классом конструкций pCy3, что объясняет небольшое увеличение времени жизни ДНК, связанной с pCy3 (дополнительный рис.4в). С другой стороны, скорость, зависящая от фотоизомеризации ( k _iso ) из возбужденного транс-состояния в чистой воде, показала ~ 20-кратное различие между свободным Cy3 и классом конструкций pCy3 (дополнительный рис. 4d). . Взятые вместе, эти два наблюдения показали, что разница в начальном времени жизни между различными конструкциями происходит в основном из-за пути фотоизомеризации.

Затем мы исследовали влияние общей структуры комплекса олиго-краситель с учетом конкретной последовательности, линкера и положения флуорофора на время жизни флуоресценции флуорофора.Мы предположили, что отжиг комплементарной цепи олигонуклеотида нарушит структуру, образованную комплексом олиго-краситель, точно так же, как и связывание с белком. Мы проверили эту гипотезу на подмножестве внутренней библиотеки олигонуклеотидов, меченных pCy3 (рис. 3d). Отжиг их комплементарных цепей индуцировал модуляции флуоресценции (NAIFE для усиления или NAIFQ для гашения; рис. 4c), которые следовали общему принципу, наблюдаемому с системой ssDNA / ssDNA-связывающих белков. Это демонстрирует, что модуляция флуоресценции необязательно должна ассоциироваться со специфическим связыванием белка, а скорее с молекулой, которая способствует взаимодействию, в данном случае с олигонуклеотидами, меченными pCy3.Более того, антикорреляция между начальным временем жизни и изменением флуоресценции все еще диктовала направление модуляции флуоресценции.

В случае экологически чувствительных флуорофоров понятие единственного срока службы заменяется широким спектром времен жизни, к которым этот флуорофор имеет доступ в различных средах и конфигурациях. Это было ранее охарактеризовано с использованием микроматрицы коротких олигонуклеотидов ДНК, меченных Cy3 или Cy5, проанализированных на их относительную интенсивность ^18,19,38 .Однако эти исследования были ограничены, поскольку единственной характеристикой переменной была короткая последовательность ДНК. Здесь мы составили список доступных значений времени жизни Cy3 на основе очень значительного числа ( N = 398) измерений времени жизни, охватывающих различные контексты, такие как последовательность ДНК, химический состав линкера, буферные условия, конформация ДНК и ассоциация белков (рис. . 4d). Этот ландшафт простирался между двумя крайними значениями: свободным Cy3 в воде и значением O-328 (18) в буфере RPA.

Наконец, поскольку O-328 выделяется как имеющий самую высокую флуоресценцию Cy3, мы дополнительно исследовали основу его высокой флуоресценции. Мы предположили, что такая высокая флуоресценция может быть связана с ригидностью возбужденного транс-состояния, налагаемой общей структурной конфигурацией ДНК и, возможно, дополнительным эффектом других путей помимо фотоизомеризации. Чтобы проверить гипотезу ригидности, мы систематически изменяли эту структурную конфигурацию, сокращая размер O-328 на два нуклеотида за раз, с 22 нт (O-328) до 8 нт (рис.4д). Продолжительность жизни этих олигонуклеотидов оставалась в основном неизменной, вплоть до 16 нт, после чего время жизни постепенно уменьшалось. После отжига соответствующих комплементарных цепей образованная дцДНК показывала постоянное меньшее время жизни при разной длине. Взятые вместе, эти результаты показывают, что специфическая структура ДНК может формироваться в ядре O-328 (центральные 16 нт) в контексте буфера RPA. Мы предположили, что вязкость буфера, ионная сила, pH и / или двухвалентные металлы могут влиять на структуру ДНК-красителя и, следовательно, на флуоресценцию красителя.Мы измерили время жизни флуоресценции O-328 в растворах, содержащих каждый из компонентов буфера отдельно (рис. 4f). Удивительно, но O-328 потерял свою чрезвычайно высокую флуоресценцию в воде и других растворах, за исключением раствора, содержащего 50 мМ KCl, что позволяет предположить, что ионы калия вызывают образование вторичной структуры внутри O-328.

Мы дополнительно исследовали фотофизические свойства O-328, чтобы лучше понять особенности его высокой флуоресценции помимо ингибирования фотоизомеризации.Спектры поглощения и испускания O-328 не показали значительных спектральных сдвигов во всех контекстах Cy3 (свободный, случайный олигонуклеотид, O-328, с или без K ⁺ ) (дополнительный рисунок 4e). Разделение скоростей высвечивания (дополнительный рис. 4f) предполагает, что сверхусиленная флуоресценция в O-328 при связывании K ⁺ по сравнению с Cy3B, скорее всего, происходит из-за немного продолжительного радиационного распада и пониженной скорости не- радиационные пути за пределами фотоизомеризации.

PIFQ можно использовать на уровне одной молекулы.

Чтобы исследовать применимость PIFQ к методам работы с одной молекулой, мы попытались охарактеризовать каталитическую эффективность FEN1, используя DF с одной меткой.В нашей предыдущей работе мы использовали DF-6,1 с pCy3, помещенным на кончике заслонки, и Alexa Fluor 647 после зазубрины ^25,27,28 . При такой схеме мечения связывание FEN1 и изгиб ДНК вызывают сдвиг FRET от 0,8 до 0,48 для нескольких кадров, прежде чем FEN1 расщепляет меченный pCy3 5′-лоскут, что приводит к мгновенной потере 5′-лоскута и, как следствие, FRET (рис. 5a и дополнительный рис. 5a) ^25,27 . Распределение времени пребывания, проведенного в изогнутом состоянии, подогнанное к гамма-распределению, усредненное на уровне ~ 163 мс, использовалось для оценки каталитических скоростей однократного оборота ²⁵ .

PIFQ можно использовать на уровне одной молекулы для определения каталитической кинетики FEN1. анализ расщепления smFRET, используемый для отслеживания каталитической кинетики FEN1 на субстрате DF-6,1. Вверху: схематическое изображение экспериментального подхода. Внизу: репрезентативный след одной молекулы события расщепления, показывающий изменение FRET и последующую потерю сигнала. Распределение времени нахождения в изогнутом состоянии для N = 131 событий расщепления было построено и подогнано к гамма-распределению.Приводятся среднее значение и стандартная ошибка среднего. b Анализ одномолекулярного расщепления (smPIFQ) с одной меткой (pCy3), помещенной на кончике лоскута. Вверху: схематическое изображение конструкции анализа. Внизу: характерный след одной молекулы, контролирующий тушение флуоресценции pCy3 при взаимодействии с FEN1 и последующей потере сигнала. Время, проведенное в закаленном состоянии, количественно оценивается для N = 213 событий, и его распределение строится и аппроксимируется экспоненциальным спадом с указанием среднего значения и стандартной ошибки среднего. c Типичная кривая smFRET, показывающая изменение FRET (выделено серым) и общее изменение интенсивности (выделено голубым цветом) до потери сигнала. Общее изменение интенсивности соответствует гашению сигнала Cy3. d Гистограмма, показывающая обратную величину отношения сигнал / шум (1 / SNR показано серым цветом) и абсолютное относительное изменение (AFC показано голубым цветом) (голубой) для следов расщепления smFRET и smPIFQ, как описано в Раздел «Методы СИ». Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам среднего (SEM) 1 / SNR и AFC в каждом случае.В обоих случаях для анализа использовалось N = 100 трасс. Значение p ( p <0,001) вычисляется для оценки статистической разницы между 1 / SNR и AFC с использованием двухвыборочного теста t для трасс расщепления как smFRET, так и smPIFQ. В таблице-вставке показаны значения p , полученные с помощью теста нормальности Колмогорова – Смирнова (KS) для четырех наборов данных. Тест KS не смог отклонить нулевую гипотезу о нормальном распределении данных, как указано p > 0.05. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение N = 100 кривых, а ± представляет стандартное отклонение. Измерения для a — c регистрировали с временным разрешением 50 мс.

Как показано на фиг. 2, связывание FEN1 с DF-6,1 индуцировало 40% тушение флуоресценции 5′-створок, меченных pCy3. Этот PIFQ может быть полезным анализом расщепления одной молекулы, поскольку он может снизить сложность анализа расщепления smFRET, особенно при выборе оптимизированной пары FRET, детектируемом изменении FRET и стабильности акцепторов.Кроме того, расщепление с помощью FRET сообщает о всех каталитических стадиях после изгиба ДНК, тогда как расщепление с помощью PIFQ может сообщать только о конкретных каталитических стадиях. В анализе smPIFQ (фиг. 5b) связывание FEN1 вызывает одностадийное тушение до потери сигнала (фиг. 5b и дополнительный рисунок 5b). Эта стадия гашения интерпретируется как распознавание FEN1 своего субстрата, в то время как потеря сигнала pCy3 отмечает мгновенное высвобождение 5′-лоскута. Наша уверенность в том, что потеря pCy3 связана с расщеплением 5′-лоскута, а не с фотообесцвечиванием, подкрепляется тем фактом, что pCy3 стабилен в отсутствие FEN1 в аналогичных буферных условиях ²⁵ .Более того, как в smFRET, так и в smPIFQ, изменения FRET и флуоресценции, соответственно, значительно отличаются от шума, как показано на рис. 5d и описано в разделе «Методы SI». Следовательно, даже изменение, происходящее в одном кадре, можно уверенно отнести к изменению FRET или PIFQ.

Удивительно, но распределение времени пребывания перед отщеплением от smPIFQ показало одноэкспоненциальное затухание (рис. 5b), что указывает на единственную лимитирующую стадию, в отличие от распределения нарастания и затухания, наблюдаемого с помощью анализа расщепления smFRET (рис.5а). Кроме того, среднее время ожидания для smPIFQ (116 мс) было немного меньше, чем для smFRET (163 мс). Мы предполагаем, что разницу в средних временах пребывания и паттерны распределения этих времен пребывания, полученные с помощью двух анализов, можно интерпретировать таким образом, чтобы smPIFQ и smFRET начали сообщать в разные моменты времени реакции расщепления FEN1. Возможно, что FEN1 вызывает гашение флуоресценции Cy3 только после того, как лоскут полностью заправлен и позиционирован, тогда как smFRET начинает сообщать об изгибе ДНК перед этапом заправки.Эти результаты раскрывают важную механистическую информацию, касающуюся времени нарезания нити 5′-лоскута в связи с изгибом ДНК ²⁵ . Что еще более важно, это показывает, что smPIFQ можно использовать для изучения различных аспектов этого пути расщепления, тем самым обеспечивая дополнительное измерение и добавление к информации, уже полученной из анализов smFRET ^25,27 .

Более того, FRET и PIFQ можно контролировать одновременно в одном и том же эксперименте по расщеплению smFRET, как сообщалось ранее для smFRET / smPIFE ³⁹ , отслеживая изменение FRET, а также изменение общей интенсивности флуоресценции как донора, так и акцептора. .Это позволило нам различить исходные точки обоих явлений. Временные диаграммы показали более низкое состояние FRET, охватывающее среднее время пребывания, равное 163 мс (рис. 5a). Тем не менее, в течение этого времени выдержки можно различить два отдельных шага: на первом сохраняется общая интенсивность флуоресценции, а на втором снижается общая интенсивность флуоресценции (рис. 5c и дополнительный рис. 5c). Второй этап соответствует тушению донора непосредственно перед отщеплением. Возникновение изменения FRET до PIFQ подтверждает нашу интерпретацию, согласно которой PIFQ, скорее всего, сообщает о шаге, включающем продевание 5′-лоскута после изгиба ДНК.

Наша следующая система фокусировалась на усилении флуоресценции O-328, индуцированной K ⁺ (рис. 4f). Мы предположили, что K ⁺ изменяет общую структуру Cy3-меченного олиго, возможно, за счет образования некоторой вторичной структуры, подобной случаю G-quadruplexes ⁴⁰ . Затем ожидается, что добавление RPA, белка, который, как известно, плавит вторичные структуры ⁴¹ , погасит высоко флуоресцентный O-328 / K ⁺ и попытается восстановить исходное флуоресцентное состояние O-328.Однако эта гипотеза предполагает одно предостережение; возможно, добавление K ⁺ вызывает образование димера, а не вторичной структуры мономера. Чтобы проверить эту гипотезу, мы прибегли к тесту с одной молекулой, в котором используется более длинный олиго, содержащий последовательность O-328 на одном конце и отожженный до биотинилированного олиго на другом конце, создавая соединение праймер / матрица (P / T). . Это гарантировало, что флуоресцентный конец O-328 был свободен и далеко от поверхности. Такая конструкция обеспечивала хорошо разнесенную поверхность, на которой образование димера было практически невозможно.В отсутствие K ⁺ соединение P / T показало профиль интенсивности с низкой флуоресценцией, который явно сдвигался в режим более высокой флуоресценции при добавлении 50 мМ KCl (рис. 6a), аналогично тому, что мы наблюдали с использованием объемные измерения времени жизни (рис. 4f). Что еще более важно, временные кривые после введения KCl (рис. 6a и дополнительный рис. 5d) показали начальный мгновенный переход, за которым следует стабильное более высокое состояние флуоресценции. Этот переход интенсивности Cy3 интерпретируется как динамический переход между двумя состояниями в системе связывания с двумя состояниями.Это указывает на то, что усиление флуоресценции, индуцированное K ⁺ , представляет собой одностадийный процесс (в пределах нашего временного разрешения), а не прогрессивный процесс, который проходит через несколько состояний для достижения своего максимума. Более того, временные кривые демонстрируют одноэтапные события фотообесцвечивания, дополнительно подтверждая мономерную природу P / T-перехода (рис. 6a и дополнительный рис. 5d).

Структурные изменения ДНК отслеживаются с помощью модуляции флуоресценции Cy3. a Образование вторичной структуры.Слева: схематическое изображение экспериментальной установки. При добавлении K ⁺ образуется вторичная структура, приводящая к усилению флуоресценции Cy3. В центре: гистограммы интенсивности флуоресценции Cy3 с (зеленый) K ⁺ . Гистограммы соответствуют гауссовским распределениям. Справа: характерный след одной молекулы, показывающий переходы в состояние повышенной флуоресценции при образовании вторичной структуры в результате связывания K ⁺ . б Плавление вторичной структуры.Слева: схематический рисунок, показывающий конструкцию ДНК, используемую в c , с вторичной структурой, образованной в присутствии K ⁺ . Однако при добавлении RPA эта вторичная структура плавится, что приводит к тушению флуоресценции Cy3. В центре: гистограммы интенсивности флуоресценции Cy3 в отсутствие (зеленый) и присутствие (синий) RPA. Гистограммы соответствуют гауссовским распределениям. Справа: репрезентативный след одной молекулы, показывающий переходы в состояние тушенной флуоресценции при плавлении вторичной структуры, вызванной связыванием RPA, измерения для a и b были записаны с временным разрешением 100 мс

Далее мы проверили, может ли RPA расплавить эту вторичную структуру, индуцированную K ⁺ .Используя тот же P / T-переход, мы подтвердили высокоинтенсивный профиль этой подложки в присутствии KCl, который подавлялся при добавлении RPA (рис. 6b). Это указывает на то, что RPA способен расплавить вторичную структуру и обратить усиление флуоресценции, индуцированное K ⁺ , на профиль более низкой интенсивности. Временные диаграммы (рис. 6b и дополнительный рис. 5e) показали одноэтапное тушение после связывания RPA, а также одноэтапные события фотообесцвечивания.

Взятые вместе, эти исследования одиночных молекул показывают, как модуляцию флуоресценции, если ее контролировать, можно использовать для понимания различных биохимических явлений на уровне одной молекулы.Как расщепление одномолекулярного FEN1, так и мониторинг структурных изменений, вызванных K ⁺ в O-328, а также его разрушение с помощью RPA, являются примерами, которые можно легко изучить с помощью одного флуорофора.

9 упражнений, подходов и повторений

Хотите вернуться к простым корням тренировки со штангой? Раньше, когда гири и бродяги не затуманивали наш разум, тренировка была такой же простой, как хватание штанги, повторение за повторением, движение за движением, и все это без падения штанги.Хотя тренировки нового поколения изменили правила игры к лучшему: спортсмены и тренирующиеся стали более мощными, мобильными и в целом более крутыми, чем когда-либо прежде, в расписании тренировок еще есть место, чтобы вернуть штангу в руки!

Техника, которая сейчас популяризируется и считается комплексным кондиционированием , обеспечивает тренировочный эффект для набора некоторой мышечной массы, но также сжигает жир и подталкивает вашу физическую форму до высшей степени в процессе. Не зацикливайтесь на этом! После моего опыта консультирования в Китае с Олимпийским комитетом Китая и их многочисленными национальными командами (включая тяжелую атлетику) стало ясно, что этот старый школьный метод по-прежнему является основным продуктом в самых эффективных программах олимпийских атлетов.Когда я в последний раз проверял, эти парни — одни из самых сильных людей в мире!

Готовы к интеллектуальному поджигу? Попробуйте этот комплекс, используя только штангу и вашу с собственным весом . Подождите, вы сразу же подползете к своей гири, желая, чтобы вы никогда не слышали о комплексе со штангой!

1. Чистота жима — 7

2. Приседания над головой — 7

3.Румынская становая тяга — 7

4. Тяга в наклоне — 7

5. Становая тяга — 7

6. Приседания с собственным весом — 10

7. Отжимания — 10

8. Чередующиеся обратные выпады — 20 Всего

9. Альпинисты — 20 Всего

Вес штанги будет одинаковым на протяжении всего комплекса (движения 1-5). Ключом к успешной оптимизации этого программирования является выбор веса, при котором вы сможете выполнить 7 повторений самого слабого упражнения.Для большинства людей самым слабым движением будет чистый жим из-за строго вертикальной ориентации жима с использованием только верхней части тела при сохранении сильного нейтрального положения кора. Вот почему это первая часть в комплексе. Определите, какой вес вы можете сделать за семь повторений с максимальным усилием (оставив, возможно, одно повторение в баке) с идеальной формой, и вот оно, готово! Это будет ваш начальный вес для комплекса. Готовый? Получите это!

Цель первых 5 движений комплекса — удерживать штангу в руках, не роняя ее, пока вы не дойдете до весовой части комплекса.Начиная с упражнения «От чистого к прессу», вы будете выполнять каждое упражнение с предписанным количеством повторений без отдыха, пока не завершите свое последнее повторение альпиниста. Приветствуйте горящие легкие и дрожащие от радости мускулы; ты это заслужил.

После того, как вы растерзаете весь комплекс, можно взять 30-90 секунд отдыха для восстановления между подходами. Помните, что чем быстрее и эффективнее вы продвигаетесь по комплексу, тем меньше времени на отдых вам понадобится, чтобы подготовиться к следующему подходу, поэтому убедитесь, что вы приближаетесь к грани своих сердечно-сосудистых ограничений и точек механического сбоя при каждом движении! Цель состоит в том, чтобы отдыхать как минимум, поэтому поставьте перед собой задачу как можно скорее вернуть руки на перекладину.Один из способов сохранить прогресс в правильном направлении — это минимизировать периоды отдыха с течением времени за счет увеличения мышечной выносливости и эффективности сердечно-сосудистой системы.

Повторите комплекс 3-5 подходов, в зависимости от вашего общего уровня подготовки. Убедитесь, что вы поставили цель тренировки и достигли ее, будь то количество циклов в комплексе или соблюдение заранее определенного периода отдыха. Записывайте, отслеживайте и обязательно придерживайтесь этого. И не забудьте бросить вызов себе; это не должно быть легко! Перед тем как начать, запишите свою нагрузку, периоды отдыха и количество подходов.Придерживайтесь программы и преодолевайте боль, которую вам предстоит пережить!

• Нагрузка — Очистка до прессования 7RM (сохранение первоначальной формы и ритма)
• Наборы — 3-5 +
• Отдых — 30-90 секунд

сложный. Это один из старейших методов в долгой истории силовых тренировок. Возможно, нет лучшего способа одновременно тренировать вашу метаболическую систему, работая над техникой и эффективностью сложных движений со штангой, чем с этим типом комплекса.

Это программа, которую я использую сам, со своими спортсменами и клиентами в первую очередь для поддержания физической формы. Дать ему шанс; это один из наиболее хорошо сбалансированных комплексов всего тела, которые я когда-либо программировал. И под хорошо сбалансированным, я имею в виду, что это заставит вас лежать на спине и молиться о завершении тренировки!

Не ограничивайтесь только штангой. Не стесняйтесь создавать комплексы с любым типом загруженного оборудования (RMT Club, Ropes, Dumbbells, Kettlebells и т. Д.) Для отличной тренировки. Кроме того, выбирайте движения для комплекса для любой тренировочной цели, на которой вы в данный момент сосредотачиваетесь.Возможности безграничны! Наслаждайтесь своими достижениями.

Об авторе: Доктор Джон Русин — тренер по силовой и физической подготовке и физиотерапевт по спортивным показателям, специализирующийся на разработке программ для спортсменов и клиентов. Целеустремленная цель Джона состоит в том, чтобы преодолеть постоянно растущий разрыв между высокими показателями силы и кондиционирования и передовыми программами реабилитации для элитных силовых атлетов. От спортсменов НФЛ и MLB до соревнующихся пауэрлифтеров и бодибилдеров Джон разработал программы восстановления, регенерации и предварительной реабилитации для некоторых из лучших силовых атлетов мира как лично, так и с помощью онлайн-платформы.Джон является владельцем компании JR Fitness Systems, расположенной в Мэдисоне, штат Висконсин. Для получения дополнительной информации о практических методах самостоятельной миофасциальной разрядки или о докторе Джоне, напишите ему по электронной почте [email protected] или посетите следующие страницы: Веб-сайт www.drjohnrusin.com | Facebook: Фитнес-системы Джона Русина | Twitter @johnrusin

Если вам понравилась эта статья, ознакомьтесь с другими статьями Джона

Динамическая разминка для спортсменов с верхней частью во избежание травм

5 упражнений на укрепление колен для уменьшения травм

(PDF) На мягком комплексе наборы и мягкие комплексные числа

О мягких комплексных наборах и мягких комплексных числах 215

() ()

{

)

2

inf 4 2 2fzdz S SL

le

<+

ÚC, A

л

дюймов Œ.

Для каждого A

l

Œ и положительного числа

, правый элемент здесь можно сделать

равным

, присвоив правильное значение положительному числу

e

. Таким образом, неравенство (1)

установлено, и теорема доказана.

Теорема 3.7.25 (теорема Коши для мягкой функции мягких комплексных чисел). Если программная функция f мягких комплексных чисел

является аналитической во всех точках внутри и на простом замкнутом контуре C

, то

)

0fzdz =

ÚC i.e.,

()

)

()

0fzdz

l

=

ÚC, A

l

.

Справочные документы

2735.

[2] К. Атанасов, Интуиционистские нечеткие множества, Нечеткие множества и системы, 20 (1986), 87-96.

[ 3] Дж. Дж. Бакли, Нечеткие комплексные числа, Нечеткие множества и системы, 33 (1989), 333-345.

[4] Дж. Бакли, Ю. Ку, Нечеткий кольплексный анализ. I, Дифференцирование, нечеткие множества и системы, 41 (1991),

269-284.

[5] С. Дас и С. К. Саманта, Мягкие действительные множества, мягкие действительные числа и их свойства, Журнал нечеткой математики

. 20 (3) (2012), 551-576.

[6] Д. Дюбуа и Х. Прад, Постепенные элементы в нечетких множествах, Мягкие вычисления, 12 (208), 165-175.

[7] Дж. Фортин, Д. Дюбуа и Х. Прад, Постепенные числа и их приложения к нечеткому интервальному анализу,

IEEE Transaction on Fuzzy Systems, 16 (2) (2008), 388-402.

[8] Дж. Клир и Б. Юань, Нечеткие множества и нечеткая логика, Теория и приложения, Прентик-Холл, Индия,

(1997).

[9] П. К. Маджи, Р. Бисвас, А. Р. Рой и теория мягких множеств, Computers Math. Applic., 45 (2003), 555-

562.

[10] PK Maji, R. Biswas, AR Roy, Fuzzy soft sets, The J of fuzzy Math, 9 (3) (2001), 589-602 .

[11] П. Маджумдар, С. К. Саманта, Мера подобия мягких множеств, World Scientific Publishing

Company, vol.4, № 1 (2008), 1-12.

[12] Д. Молодцов, Первые результаты теории мягких множеств, Computers Math. Applic, 37 (4/5) (1999), 19-31.

[13] З. Павлак, Грубые множества, Международный журнал информации и компьютерных наук 11, (1982), 341-

356.

[14] З. Павлак, Жесткие и программные множества, отчет об исследовании ICS, Институт информатики, Польша, (1994).

[15] Л. А. Заде, Нечеткие множества, Инфор. И Контроль, 8 (1965), 338-353.

[16] Д.Чен, Параметризация мягких множеств и ее приложения, Ж. вычисл. Математика. Appl., 49

(2005), 757-763.

[17] Д. Пи и Д. Мяо, От программных наборов к информационным системам, Graqnular computing, (2005), IEEE linter.

конф. 2. 617-622.

[18] З. Конг, Л. Гао, Л. Вонг и С. Ли, Нормальное сокращение параметров мягких множеств и его алгоритм, J.

Comp. Прил. Матем., 56 (2008), 3029-3037.